慢病毒转染的疑惑？

cc1986

刚开始做，有个问题想弄明白
; ~* n& o6 Y" ]$ M1 X$ ^* D( G我的慢病毒载体上有耐药基因 ，绿色荧光蛋白基因，和目的基因。。慢病毒载体转导到目的细胞里面后有很高的几率整合到目的细胞的基因组里，问题是：
5 P3 i: N9 V3 o1 在转导成功后，是不是细胞质和细胞核同时慢病毒载体，而且细胞质和细胞核会同时表达耐药蛋白和绿色荧 光蛋白及目的蛋白？9 [+ ~" ^8 _, C1 D0 S& J
2 是否整合进去就意味着这三个基因一定会表达
+ g! Y/ I$ H& Z" [5 p3 还有，三个基因是连在一起整合，还是三个随机组合整合的？8 q6 T5 P" `, n2 n; f  l7 ~" U( T
求解释，谢谢大家~

深海寂寞鱼

* x' c9 D0 ~5 H$ z+ y. S5 i9 L$ G3 B, A8 M! C  `. d
to cc1986：, o) L* H' x6 ?& h* O. C/ l

2 E; H  D8 m1 S* k: r+ [不知道你具体用的是哪种慢病毒载体。从你的描述来看，应该是你的目的基因和绿色荧光蛋白共用一个启动子,
5 t/ W8 V8 `# K目的基因和绿色荧光蛋白要么是融合表达(如图)" M5 y# b4 q  b) N% K: `

0 l4 p0 {4 j% A: }1 l0 D/ p要么是通过IRES连接成为双顺反子实现协同表达（如图）
* [( |' v4 }5 b1 g+ {0 q/ S+ L* S3 w7 R$ F; d
而你的耐药基因应用另一个启动子，比如PGK。$ u, |' R* ^2 u4 c) D; d

% ?7 V$ G5 N) E; z! s" l! A对于你的问题回答如下：
; i  H/ H% q" E$ W  e2 c: G
- M8 E$ U0 ]) ~, Q1.在转导成功后，是不是细胞质和细胞核同时慢病毒载体，而且细胞质和细胞核会同时表达耐药蛋白和绿色荧 光蛋白及目的蛋白？3 w0 V% z" ~0 d
) _4 P& F; m) [! T! G
回答：4 E6 M" {8 e, C1 Y0 O- K
a.慢病毒载体在刚进入细胞的时候，最先是在细胞质里的，这时候它是以RNA的形式存在。由于转导时进入细胞的除了慢病毒的RNA外，还有逆转录酶等慢病毒组分。慢病毒RNA会在逆转录酶的作用下成为DNA。(当然这个过程是不是只能在细胞质内完成，或者说既可以在细胞质也可以在细胞核，我还不是特别清楚。希望有经验的战友指教。)8 |' D/ p: ?. X0 N  M2 D

+ I2 E9 u! l: @% ub. 然后慢病毒会进入细胞核（在这点上由于慢病毒具有能促进核转入的元件cPPT/CTS）。然后慢病毒基因组会整合到靶细胞的基因组中。- A. N5 R# Z! ~2 o/ j/ j

! a7 N* ~* w% M% ]: H% N3 Nc. 对于真核细胞来说，蛋白质的合成都是在细胞质完成的，所以耐药蛋白，绿色荧光蛋白，目的基因都会是在细胞质最先合成。当然细胞核里有没有这些蛋白取决于下面的可能。
& w$ \0 `1 W* j* Y( Z! @首先，你的目的基因本身是什么蛋白，如果它是核蛋白的话，当然是可以在细胞核里的。如果目的基因本身不是一个能进入细胞核的蛋白，那么它进入细胞核的可能性就很小。
: }* H4 q5 S8 ^) `* b2 j, V1 |其次，绿色荧光蛋白分布在什么地方，要看它和目的蛋白是哪种表达。如果是融合表达，那么它的分布基本上取决于你目的蛋白的定位。如果是通过IRES的协同表达，那么细胞核和细胞质里有能看到绿色荧光蛋白。
2 I8 d# @- n) B/ j' {- K最后，至于耐药蛋白的话，它应该在细胞质的可能性最大。能不能进入细胞核，我也没看到相关知识。; L/ y8 n' U$ P- y
& I% Y0 a( x# P0 z& D/ x, E6 P
2 是否整合进去就意味着这三个基因一定会表达？
1 k5 y' r+ O9 `2 o
1 q6 _. T8 m3 j. l1 V: R回答：整合进去意味着它们表达的可能性很高，但是并不意味着它们一定会被表达。这取决于你的细胞本身，还有慢病毒载体所用的启动子，因为存在转基因沉默的问题。
: I: R8 Z3 r6 }4 j: T8 c* @2 E举例来说，我们最常用到的巨细胞病毒的启动子（CMV），在干细胞里它经常会被沉默掉。所以会有人用CAG启动子，或者EF1a等等。
2 z, E4 [- i* K: [9 e+ w# x2 w) ~
3 还有，三个基因是连在一起整合，还是三个随机组合整合的？
: ^8 N7 ]) y3 n$ o) U1 U  x  s
7 l. L8 I! H2 _) q3 R4 \; K- t0 B回答：三个基因连在一起整合的概率是最大的，整合后这三个基因的排列位置理论上和你的慢病毒载体是一致的。
+ A6 x6 Y- G/ T' r7 L0 d7 ~2 L& H% i* z
当然，一定会出现一些随机整合的现象，比如三个基因只整合其中一两个基因，或者还整合在不同的位点。但是这方面你完全不用担心。第一，这种可能性很小，既使有也不会对你的实验结果造成实质性影响。第二，既使出现了这种随机整合，这种随机整合后的基因也很难能被表达的，因为一旦慢病毒载体断开再整合，那么表达框就不完整了。
/ {5 M, O! A- d% v' V' k0 Z# L* g* x$ A6 L( o+ g% U
哈哈，说了这么多也不知道说清楚了没。希望里面的有些东西能对你有一些帮助。/ F: T" k8 v5 {! H0 y! N

- t6 t/ M8 F% g9 r5 @& H' Y! ]如果有什么没说清楚，咱们再交流吧。

绿雪

' f1 k* b9 U- o6 R" k# C4 G
' M5 P/ ~: K4 y( g$ {( J
我试着回答楼主的这几个问题吧，不妥之处，大家一起讨论。
6 ?+ O$ y' |8 q0 [6 [% C9 o1、刚开始转染时，可能会在胞质和核里共同表达，但随着时间的推移或做稳定筛选，胞质中的以附加体形式存在的载体会逐渐丢失，从而只表达整合到核基因组中的那部分。至于表达 产物的亚细胞定位，这要看蛋白的功能及所用的信号肽了。& }$ R" l+ z: P: }
2、整合并不意味着表达，如果整合到宿主异染色质部分，那么外源基因就无法表达了。这也是转基因研究的一个重要问题，即转基因沉默，所以有时会用打靶载体，以减少或避免这种位置效应。9 d- n7 i( @0 z& ]$ ^" b
3、三个基因不一定整合到同一位置，有可能被打断后整合到宿主基因组的不同位置，所以筛选基因表达时并不意味着目的基因也一定表达。另外，三个基因的连接方式也影响其表达的，同一ORF还是分别用的独立的启动子？同一启动子如果是用IRES连接不同基因的话，IRES上下游基因的表达量也有差异。

fjmedzengyue

学习

cc1986

回复 2# 深海寂寞鱼
) z9 ?/ D1 x1 P6 m+ y% c3 x+ n5 U9 o  P+ i  S# x2 T8 R" w
非常感谢你的细心解答，通过大家的指导和自己的学习，基本明白了~~感觉自己还有很多需要学习啊，加油加油~~

cc1986

回复 3# 绿雪 : u3 N9 g5 l7 k3 g% P3 r) T

: m8 b2 p- l# Z; T非常感谢，现在基本明白了~~

cc1986

回复 2# 深海寂寞鱼 / P" z% @5 W3 n% a' P$ N5 t$ [. k

2 z6 O% s3 g. N, F请问 协同表达，和融合表达各有什么优缺点？ 目的基因和GFP的表达融合的话会不会影响目的蛋白的本来的生物学特性？如果不影响，可以理解融合表达要更好么？

cc1986

回复 3# 绿雪 ) R) g0 w* s( f
$ @8 o- d' Y" _/ D5 ^
! r5 y; h  _8 W9 q
    请问 协同表达，和融合表达各有什么优缺点？ 目的基因和GFP的表达融合的话会不会影响目的蛋白的本来的生物学特性？如果不影响，可以理解融合表达要更好么？

深海寂寞鱼

to cc1986:
) ?8 f7 I" P# O& A( w* |8 b7 w" X$ m5 Y* j7 F1 l) {) I, s
   协同表达  指通过IRES将目的蛋白的基因和EGFP基因 连在一起，构成双顺反子。
' C" A7 e) X( D" h
" W/ C& `2 N; \1 Q" Q" E   转录的时候，目的基因和EGFP会被转录在一条mRNA上。但是翻译的时候，会翻译成两条多肽链。目的基因的翻译是从mRNA的5`端开始，而EGFP的翻译是核糖体结合在IRES上开始的。
7 y/ x( i* W( K. q, v; Q9 B7 b8 }6 M$ U1 C/ U- {
   协同表达的优点：不影响目的蛋白的功能
! ]* l! G/ M$ k+ U0 w: K5 J                 缺点：EGFP不能反应目的蛋白在细胞内的定位
: u1 z% Z% [, R% \; m                          EGFP和目的蛋白的表达不是1:1，所以EGFP会比融合表达的弱
* q# S/ ~! m+ C9 j$ Q% ?8 x: C8 V6 d( Y; W' q5 C! b
   融合表达 根据位置不同，分为N端融合 和 C端融合，但无论是那种目的基因和EGFP都会成为一个ORF。因此翻译后是一个融合蛋白。EGFP融合后会不会影响目的蛋白的生物学特性，要看目的蛋白本身。如果EGFP不影响目的蛋白的构象，那可能对目的蛋白的功能不会有太大的影响。如果你想知道你的目的蛋白有没有可能被影响，可以多看看文献。我发现高因子的文献里会N端和C端融合各做一个。7 x" a- N/ g; w

* q& s* K; N: U% X( t0 T- s     融合表达的优点： EGFP亮度比协同表达亮
9 M6 a* @! }( A* {; L' k. b2 x1 @$ W0 m                            能反映目的蛋白的细胞内定位) ^; d4 C1 y9 g: G5 x4 J

! r9 U& c) L; c                   缺点： 可能会影响目的蛋白的功能

绿雪

2 L3 z/ ?. y! I

, a1 I& d+ L5 ]7 K1 `6 G回复 8# cc1986
; k; Q( y" V7 e+ U( [0 B) r) K; f1 e3 {/ O. B$ z; C1 K8 `" |

( Z+ J* M4 d: A# n2 A9 \    我并不明白楼主的协同表达究竟是指什么？我是做多基因共表达的，据我的了解，多基因共表达的方式有很多，多质粒共转染，一质粒多启动子，一质粒一启动子，其中一质粒一启动子的构建方法又有很多。而所谓的协同表达是我们的目的，可以通过融合表达来实现，也可以通过非融合的方式实现，所以，在我的理解，协同表达和融合表达并不是两个平行的概念。值得一提的是，融合表达的蛋白也可以得到各自分离的蛋白，不一定都是连接在一起的，这只需要在构建融合表达载体的时候加一些特殊序列就可以了。这也是蛋白翻译后加工的一种方式，在这种方式作用下，融合表达的蛋白切割后各个单体蛋白相互独立，生物学功能不会相互影响。