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本帖最后由 深海寂寞鱼 于 2010-10-27 11:25 编辑
7 j, q, v% V6 m% X
( H* l, X5 \% eto cc1986:
* d* m% F6 d, |* J
! s$ I( w1 u2 w! m- W0 p' U% p% Y不知道你具体用的是哪种慢病毒载体。从你的描述来看,应该是你的目的基因和绿色荧光蛋白共用一个启动子,8 n7 I0 V! P2 V! n6 d! n
目的基因和绿色荧光蛋白要么是融合表达(如图); K* q C/ y; e- H6 P
+ ]. r" q+ {+ v& P! F% z9 t要么是通过IRES连接成为双顺反子实现协同表达(如图) W. ]2 `9 B. C% U" m8 ^8 I& u* H
+ I, b: ?4 s7 I& g而你的耐药基因应用另一个启动子,比如PGK。
( g$ S. _# N% q! |5 H r2 | q
]6 R, A `+ m8 _% R" @) O对于你的问题回答如下:4 q6 n9 c1 W1 O) H! n' w, m4 p N
5 l9 ^2 m) X0 O% n, s4 A4 s
1.在转导成功后,是不是细胞质和细胞核同时慢病毒载体,而且细胞质和细胞核会同时表达耐药蛋白和绿色荧 光蛋白及目的蛋白?' R& O* s/ l: [. g: _1 e! x
/ Z* `& C$ r; U; w, F7 q# \回答:
& L7 ^% |0 T8 n7 f$ y1 b+ za.慢病毒载体在刚进入细胞的时候,最先是在细胞质里的,这时候它是以RNA的形式存在。由于转导时进入细胞的除了慢病毒的RNA外,还有逆转录酶等慢病毒组分。慢病毒RNA会在逆转录酶的作用下成为DNA。(当然这个过程是不是只能在细胞质内完成,或者说既可以在细胞质也可以在细胞核,我还不是特别清楚。希望有经验的战友指教。)
* N& q$ W7 x; _- _+ E& |* t: F
% }$ A+ v6 k' p$ O8 R' ob. 然后慢病毒会进入细胞核(在这点上由于慢病毒具有能促进核转入的元件cPPT/CTS)。然后慢病毒基因组会整合到靶细胞的基因组中。 k* b- l2 o! H- S
# q+ p, W9 l9 t' u- g# tc. 对于真核细胞来说,蛋白质的合成都是在细胞质完成的,所以耐药蛋白,绿色荧光蛋白,目的基因都会是在细胞质最先合成。当然细胞核里有没有这些蛋白取决于下面的可能。. q6 X) P0 c3 Z' }2 n" S. C* S
首先,你的目的基因本身是什么蛋白,如果它是核蛋白的话,当然是可以在细胞核里的。如果目的基因本身不是一个能进入细胞核的蛋白,那么它进入细胞核的可能性就很小。
' X! f9 |4 x; W# ~& ]5 D其次,绿色荧光蛋白分布在什么地方,要看它和目的蛋白是哪种表达。如果是融合表达,那么它的分布基本上取决于你目的蛋白的定位。如果是通过IRES的协同表达,那么细胞核和细胞质里有能看到绿色荧光蛋白。
2 }/ f+ N* j) g! q3 Z% D' {最后,至于耐药蛋白的话,它应该在细胞质的可能性最大。能不能进入细胞核,我也没看到相关知识。
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7 i2 L7 X+ \8 }& ~1 O2 是否整合进去就意味着这三个基因一定会表达?8 i$ U. |4 c8 z) w
# i: z2 [3 o# M+ Y# ]9 z2 t8 j1 x. Z回答:整合进去意味着它们表达的可能性很高,但是并不意味着它们一定会被表达。这取决于你的细胞本身,还有慢病毒载体所用的启动子,因为存在转基因沉默的问题。
$ Q# m4 w8 i' r举例来说,我们最常用到的巨细胞病毒的启动子(CMV),在干细胞里它经常会被沉默掉。所以会有人用CAG启动子,或者EF1a等等。' h }' L- ~8 g7 K9 v6 C# `. t
* ?9 Q! B% A1 Q
3 还有,三个基因是连在一起整合,还是三个随机组合整合的?2 {" W# q& h. Z& O2 s' Z7 I; }+ W
) @3 o8 o. y* \* z; s) w( F2 c回答:三个基因连在一起整合的概率是最大的,整合后这三个基因的排列位置理论上和你的慢病毒载体是一致的。7 _9 u* k2 ~2 A- V2 E/ d
# P9 I P8 D% w+ n# e4 F
当然,一定会出现一些随机整合的现象,比如三个基因只整合其中一两个基因,或者还整合在不同的位点。但是这方面你完全不用担心。第一,这种可能性很小,既使有也不会对你的实验结果造成实质性影响。第二,既使出现了这种随机整合,这种随机整合后的基因也很难能被表达的,因为一旦慢病毒载体断开再整合,那么表达框就不完整了。" ~$ h0 x5 S+ b2 `0 E O4 z( s
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哈哈,说了这么多也不知道说清楚了没。希望里面的有些东西能对你有一些帮助。$ X8 ^+ H- v% U! s4 P9 z5 ~* X2 f
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如果有什么没说清楚,咱们再交流吧。 |
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