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作者：杨治，刘淼，张银刚，郭雄，许鹏作者单位：1. 西安交通大学医学院第一附属医院骨科，陕西西安 710061；2. 西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，环境与地方病研究室，陕西西安 710061；3. 西安交通大学材料学院，陕西西安 710049 1 X% F5 A6 z! Y: F# }
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【摘要】 目的 利用低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞定向分化。方法 分离人骨髓，利用梯度离心法进行MSCs的培养，取第三代细胞利用低强度间断负压诱导分化；倒置显微镜下观察细胞的形态，检测碱性磷酸酶(ALP)活性，茜素红染色观察钙结节形成，免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨保护素的表达。结果 低强度间断负压诱导2周后，细胞呈现出成骨细胞形态，ALP活性明显增强，茜素红染色可见钙结节形成，Ⅰ型胶原和骨保护素表达阳性。结论 利用低强度间断负压可以成功的诱导MSCs向成骨细胞定向分化，诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性。
& v; m/ ?, K K8 D 【关键词】负压 骨髓间充质干细胞 成骨细胞 诱导9 d8 ^5 X/ l: W' r9 ^, z6 n
Low-intensity interrupted negative pressure induces human marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts# F ]7 @0 l/ S0 D
6 {, a6 h" X+ W0 v: S Yang Zhi, Liu Miao, Zhang Yingang, Guo Xiong, Xu Peng
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(1. Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Key Laboratory of Environment and Genes Related to
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Diseases of Ministry of Education, Institute of Environmental and Endemic Diseases,Xian Jiaotong University, Xian 710061; 3. School of Materials Science and Engineering,Xian Jiaotong University, Xian 710049, China)/ @5 L4 ~: p* q4 I$ k8 ~" X
* I1 ~8 ?: B: x5 i. Y: Q ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the effect of low-intensity interrupted negative pressure on the differentiation of human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into osteoblast in vitro. MethodsMSCs were isolated from adult marrow using density gradient separation method, passage 3 cells were chosen to induce differentiation; the differentiation of MSCs was examined by phase-contrast microscopy, the determination of alkaline phosphatase (ALP) activities, alizarin-red staining and the immunohistochemistry of typeⅠcollagen and osteoprotegerin. ResultsMSCs showed a typical appearance of osteoblasts after 2 weeks induction by low-intensity interrupted negative pressure, the activities of ALP were increased significantly, calcium nodes were seen by alizarin-red staining, the expressions of collagen typeⅠ and osteoprotegerin were positive. ConclusionLow-intensity interrupted negative pressure could successfully induce human MSCs into osteoblasts and the induced cells show characteristics of osteoblasts.
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KEY WORDS: negative pressure; marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; induction
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! C! w# y0 o, k+ z- `8 ?+ e- |9 @ 近年来，负压封闭引流技术(vacaum assisted closure, VAC)在外科创面处理方面取得了巨大的成功，该项技术能改善创面血供促进创面愈合［1］。负压技术对骨组织有何作用以及作用的机制如何，能否用来促进骨折愈合、治疗骨坏死等方面，国内外尚无学者对其进行研究。本研究在预实验的基础上通过观察低强度间断负压对人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)诱导分化的影响，以阐述其作用机制，为今后在骨折愈合和骨坏死方面的研究提供理论依据。
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1材料与方法 X6 D: @& B3 X5 T5 v
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1.1材料' }2 E7 ^0 y7 `/ C, o) _
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骨髓2例取自我科诊断为髋关节骨性关节炎，行人工关节置换的手术患者，年龄分别为56岁和61岁。两例患者肝肾功能正常，无代谢性骨病及传染病，手术前经患者同意，术中截骨后经骨髓腔抽取骨髓5mL，吸入预先加有肝素的针筒备用。
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) ?. L' q) n C6 U( j! J E 1.2主要试剂与仪器
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# T3 B/ G2 @1 v L-DMEM培养基、胰蛋白酶均为Gibco产品，Percoll分离液为Sigma产品(1.073 g/mL)，胎牛血清(杭州四季青)，Ⅰ型胶原和骨保护素免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，完全培养基的组成：L-DMEM培养基加入100 mL/L胎牛血清，青、链霉素终浓度为100 u/mL，微型负压仪。
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1.3细胞原代培养
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细胞采用梯度离心法进行培养：将抽取的骨髓分装入离心管，加入 L-DMEM培养基2 mL，1 500 r/min离心5 min去除上层脂肪滴和上清，以D-Hanks液重悬细胞后平铺于Percoll分离液上，1 500 r/min离心10 min，吸取中间层的白膜层(单核细胞层)，以D-Hanks液洗涤，加入L-DMEM培养基置入无菌培养瓶中，37 ℃、5%(体积分数)的CO2孵育箱培养。
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1.4负压诱导
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取第三代细胞进行负压诱导，把24孔和6孔培养板中培养液预先吸掉4/5，打开盖置入自行设计的无菌密闭容器中，容器侧面有孔和导管与微型负压仪相连，打开负压仪设置压力为20 kPa，30 min/次，2次/d。每次诱导完毕后取出培养板补足培养液，实验分为负压诱导组和正常培养组。' S2 N- o2 ~ P, ~ ~3 d
9 i2 `0 N) L. q, x5 F5 Z) k' q/ W5 C 1.5细胞观察4 q( N2 a6 `- z/ r# o7 k
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倒置显微镜下每日观察细胞的生长情况和形态特点，拍照记录。/ c$ @! q( C+ @0 _
, [; s" B: X& { 1.6碱性磷酸酶活性的测定
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7 B% a# A" [+ f9 @3 { 诱导2周后，两组细胞用考马斯亮兰微板法测定每孔中细胞蛋白含量，采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒测定细胞ALP活性，定量测定两组细胞中平均每毫克蛋白质的ALP活性变化，比较两组的差异。% Z2 E) g( V* b; F
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1.7茜素红染色: R! L" A9 B- I1 B
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诱导2周后，倒掉培养液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3遍，茜素红染色8 h，显微镜下观察阳性结果。
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1.8免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨保护素的表达
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5 c6 b( u1 s5 Q 诱导2周后，细胞用40 g/L多聚甲醛固定20 min，进行Ⅰ型胶原和骨保护素免疫组织化学检测，一抗为鼠抗人Ⅰ型胶原和骨保护素单克隆抗体，DAB显色。
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1.9统计学处理; r) X. k6 V; T# q5 {
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应用SPSS11.0统计软件进行数据分析，结果用均数±标准差( ±s)表示，以t检验进行数据分析，P) C; p& n! B' M6 J: w. \. S
* h% h6 O$ `2 J0 X" Q 2结 果3 W6 G3 X/ f( R& X: l
, |2 \/ \+ `, p 2.1倒置相差显微镜所见的细胞形态的变化1 m3 W/ C! C; Z6 p! d3 F9 g
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用间断负压诱导的细胞增殖速度略低于正常培养组细胞，细胞形态逐渐由梭型向多角型转化，带有数个突起，数目和形态不定，10-14 d细胞融合成单层，2周后逐渐形成多个散在的致密岛状结构，而正常培养组细胞的形态大部分为梭型。诱导成功后，细胞1周左右传1代，可稳定传10代。
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9 m% J& Y* T! y 2.2ALP活性的测定6 q7 }# f% z* ~+ ? f- y9 P
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诱导2周后，间断负压诱导组的细胞ALP活性为(15.68±1.97)u/g，正常培养组为(6.34±1.21)u/g，t检验两组差异有统计学意义(P( i3 I+ q1 S5 p, S* J. e2 U& h
& j; s7 g0 W# L 2.3茜素红染色和Ⅰ型胶原及骨保护素的免疫组织化学检测, e! C5 H1 g$ |6 ?# s- B
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负压诱导2周后，茜素红染色可见多个散在分布大小形态各异的不透明棕红色钙化结节(图1A)。Ⅰ型胶原免疫组织化学染色负压组细胞胞浆中出现大量黄褐色颗粒，阳性反应(图1B)，正常培养组阴性反应；骨保护素免疫组织化学染色显示表达水平显著提高(图1C)。$ A4 n% z. h6 A9 e2 ?4 I0 b) T
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3讨 论3 r6 f7 ?1 R, e, t
( I1 M! E. r- L% o. p MSCs是骨髓中除造血干细胞以外的另一种干细胞，其来源稳定、分离培养相对简单及具有多向分化的能力，因而成为近年来研究的热点。同源MSCs不发生免疫排斥反应，取材方便，是组织工程骨种子细胞的良好选择。由于MSCs是骨修复过程中成骨祖细胞的主要来源，作者为了揭示负压诱导对骨折、骨不连及骨坏死有何作用，首先从细胞角度研究负压诱导对人MSCs分化的影响。本实验立足于国内外学者对于负压封闭引流技术的实验研究及临床应用的基础之上，实验过程中将含少量培养液的MSCs培养板放在无菌密闭负压容器之中时，容器内的负压使细胞表面受到牵张应力的同时，也导致细胞缺氧。作者考虑高强度负压条件下会导致MSCs细胞凋亡急剧增加，所以采用低强度间断负压进行诱导培养。
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作者认为负压诱导对MSCs分化的影响主要是通过机械刺激和细胞缺氧两种机制共同作用的结果，激活细胞内信号传递通道。实验过程中细胞表面受到牵张应力的机械刺激。机械刺激是细胞在生物进化过程中受到的最基本刺激之一，适当的力学刺激可促进其生长分化。生物机械刺激是影响骨组织形成和分化的主要外源性因素，力学信号传递至细胞内从而启动和调节相关基因蛋白的表达分布［2］。Aaron等［3］对MSCs间断施加机械刺激表明可以促进细胞外基质的合成和骨成熟，Wiesmann等［4］应用牵张应力作用于MSCs 3周发现Ⅰ型胶原和骨连接素表达增强，细胞有明显矿化结节形成，Simmons等［5］利用牵张应力与成骨性诱导剂复合干预MSCs，发现细胞外基质矿化是对照组的2.3倍。细胞的基质矿化和成骨性分化是通过ERK1/2信号介导。我们发现低强度间断负压可以使MSCsⅠ型胶原表达增强，进而促进了细胞的成骨分化；负压诱导过程中，细胞在受到牵张应力作用的同时还合并缺氧。Lennon等［6］研究发现，低氧条件下培养大鼠MSCs能增加其骨形成能力。HIF-1是调节氧稳态的核心转录因子，在机体的生理和病理过程中起关键性作用。低氧引起骨系细胞的功能变化主要通过HIF-1α来介导。HIF-1α及其下游基因VEGF表达增加，从而改善骨组织血供代偿低氧状态［7］。Towler等［8］认为在骨组织发育和塑型改建过程中HIF-1α具有促进成骨细胞发育和分化的作用，提升HIF-1α介导可以加速细胞的成骨作用促进骨折修复。负压诱导中HIF-1α和Ⅰ型胶原两者之间应该有协同关系。Ⅰ型胶原的表达一方面与应力刺激有关，另一方面可能通过HIF-1α来介导，这有待进一步的研究。实验检测指标ALP是细胞向成骨细胞分化的重要标志酶，是成骨细胞早期和中期分化的重要标志，也是评价机体成骨活性和组织分化能力的特异性指标。ALP的活性高低与成骨细胞分化呈正相关关系。本实验结果显示经间断负压诱导后MSCs的ALP活性比正常培养组显著提高，具有统计学意义；成骨细胞在钙化条件下培养具有体外矿化这一特点，也是成骨细胞的一种标志。本实验通过茜素红染色，发现负压诱导2周后可见多个散在分布大小形态各异的不透明棕红色钙化结节。杨林等［9］发现人MSCs向成骨细胞分化过程中骨保护素的表达逐渐提高。本研究结果显示间断负压诱导可以促进MSCs对骨保护素的高表达，与其结论一致。综上所述，本实验通过间断负压诱导后的细胞为成骨细胞，进一步证实分离培养的细胞为成骨细胞的前体细胞MSCs。但是，本实验方法中机械刺激的生物信号和HIF-1α调控两者联合作用的分子生物学机制尚须进一步的研究。3 s$ b1 `' k |
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我们通过间断负压成功的诱导体外培养的人MSCs向成骨细胞分化，细胞可以稳定传代。一方面说明人MSCs经体外间断负压培养扩增后可以得到相当数量的成骨细胞，种植于具有良好生物相容性和可塑性的细胞支架上，将为组织工程学修复骨或软骨缺损提供更广阔的来源；另一方面为我们进行负压诱导对骨折、骨不连及骨坏死影响的实验研究打下了良好的基础，为其尽早的服务于骨科临床提供依据。( z/ v* E+ P. ~4 |& Q/ t/ x4 |
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发表于 2009-3-3 12:29
发表于 2015-6-8 21:26
