一个月的神经干细胞培养，请大家提出宝贵的意见（附图）

荤荤

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我已经花了一个月的时间培养神经干细胞，结果却不尽如人意，在此愿意把我实验的全过程写出来，希望与各位战友交流交流，也请大家不吝提出您宝贵的意见，在此我先谢谢啦: j( r  w& U8 F1 n# j3 n0 n- v! I
实验过程：
/ {: I# T8 E' H: h. j/ Q1.尝试过取新生小鼠的全脑和新生大鼠的海马（培养结果都不满意），剥离脑膜血管，组织剪碎，滴管吹打50次（吹打的手法和次数不知是否需要改进），200目筛网过滤，1200rpm离心5min,1ml培养基重悬，血细胞计数器计数4 }! t1 h: D4 R& ]1 m) S5 l
2.以5X10E5/ml密度接种于含6ml完全培养液的50ml培养瓶中（培养基是DMEM/F12+20ng/mlEGF+20ng/ml bFGF+2%B27+2%双抗），之前由于担心细胞贴壁，我是将培养瓶以其一个底脚为支点，斜靠在培养箱里的，但是问题就是细胞全到那个小角里，成球的互相之间也容易粘附，上层基本看不到细胞。后来把培养瓶平放过来，结果神经球又容易贴壁，不知道各位战友是如何解决这个问题的。
" Z8 U( W3 ]/ Q- p: d3.原代培养24小时半量换液一次，以后三天换液一次，7天传代。换液是吸去一半上层液体，以完全培养液代替。传代是先将细胞转移到15ml的离心管，1000rpm离心5min，弃上清，加1ml的培养液，用1ml枪吹打50次，再将细胞接种到培养瓶中。$ c# x& {6 R1 E9 V. \$ W

, w* R2 v4 w; I5 j1 f) P我现在的主要问题是，原代培养的时候基本上4天左右就能形成很漂亮的球，7天球的直径一般能达到100um以上，但是传代之后，细胞不见增加，成球能力大大下降，7天时球的直径还没有原代3天的好，而且看起来折光度也没之前的好。1：1传代的话还能看到许多单细胞，只是球比较少，若以1：2传代的话，球更少，连单细胞也少很多。传到2代的话，情况就更差了。
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' a8 j, m& j9 |& J4 M附件里是原代培养第6天的细胞，传代后细胞状态太差，就没拍过照片了。5 A' o9 ]" X8 C
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实验时间紧迫，非常着急，大家交流一下啊。

bathpp2007

很好的讨论

shqinzhu

我是来学习的，看了收获很大，谢谢各位，希望以后多多交流

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Ww我也想知道怎么才能使细胞不贴壁?

sleeq

我很好奇为什么没有用Neurobasal？没有它传代能很好的支持么？（我也很疑惑）

SVZ

回复 hello-jun 的帖子% m/ F4 ~# U6 k/ F, I5 C

& a& E+ d$ F+ x$ p/ _Hell-jun，你好：我最近就是在为我的干细胞不贴壁的事情苦恼，以前贴的好好的，就用poly-d-lysines就ok，现在加了LN也不怎么贴。我查了资料，怀疑量大可能：支原体污染和消化过渡。我的细胞增殖速度很快，所以排除支原体污染，消化一点都不比以前重。搞不懂为什么？请问你的问题现在解决了吗？另，你是如何使细胞均匀铺板的，恳请回复，谢谢！

李玉桃

最好是重新配置培养液，用NaOH调至PH=7.2（精确PH试纸来判断）。还有细胞不贴壁的话为什么不用多聚懒氨酸(0.01%浓度)来使细胞贴壁呢

jennyshy

回复 荤荤 的帖子
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2 q: f$ t9 Q, f2 o- e% Y. S我养过胎鼠和乳鼠的神经干
0 C) q! t1 N) I: I1 h8 \- ^个人认为胎鼠优于乳鼠
8 p. V$ l  W& T& z' [* R; n2 C" w
从你初期的图片看有几个问题你需要改进一下1. 原代4d神经球过大，会导致后面几代增值力下降，因为原代时已经有大部分神经干死亡，所以你需要控制原代神经球的大小，不是非要到7d才传代。2. 原代组织消化最好不要用胰酶，会粘连，建议用Accutase  sigma的 3. 培养瓶养是不会贴壁的，如果贴壁是你原代处理的不好

hello-jun

我们培养的时候都是在培养皿里面培养的 我不知道为什么你的在瓶里就很容易贴壁 我的要让细胞贴壁的话 还需要加pdl 加 LN处理以后才会贴 有时候处理不好的话 还比贴  你那个真好 自己就贴上去了

hello-jun

我觉得你这个挺好的啊  和我们培养的差不多 像你这么大的时候 我们早就开始传代了