一个月的神经干细胞培养，请大家提出宝贵的意见（附图）

荤荤

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我已经花了一个月的时间培养神经干细胞，结果却不尽如人意，在此愿意把我实验的全过程写出来，希望与各位战友交流交流，也请大家不吝提出您宝贵的意见，在此我先谢谢啦
7 j2 m  S8 E; z8 P7 q5 m实验过程：
' a0 _6 P. H- M5 M& Z1.尝试过取新生小鼠的全脑和新生大鼠的海马（培养结果都不满意），剥离脑膜血管，组织剪碎，滴管吹打50次（吹打的手法和次数不知是否需要改进），200目筛网过滤，1200rpm离心5min,1ml培养基重悬，血细胞计数器计数% K$ U; H, j; `* K! m7 z
2.以5X10E5/ml密度接种于含6ml完全培养液的50ml培养瓶中（培养基是DMEM/F12+20ng/mlEGF+20ng/ml bFGF+2%B27+2%双抗），之前由于担心细胞贴壁，我是将培养瓶以其一个底脚为支点，斜靠在培养箱里的，但是问题就是细胞全到那个小角里，成球的互相之间也容易粘附，上层基本看不到细胞。后来把培养瓶平放过来，结果神经球又容易贴壁，不知道各位战友是如何解决这个问题的。) c/ ?$ D# r/ c
3.原代培养24小时半量换液一次，以后三天换液一次，7天传代。换液是吸去一半上层液体，以完全培养液代替。传代是先将细胞转移到15ml的离心管，1000rpm离心5min，弃上清，加1ml的培养液，用1ml枪吹打50次，再将细胞接种到培养瓶中。
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我现在的主要问题是，原代培养的时候基本上4天左右就能形成很漂亮的球，7天球的直径一般能达到100um以上，但是传代之后，细胞不见增加，成球能力大大下降，7天时球的直径还没有原代3天的好，而且看起来折光度也没之前的好。1：1传代的话还能看到许多单细胞，只是球比较少，若以1：2传代的话，球更少，连单细胞也少很多。传到2代的话，情况就更差了。$ N! t- T3 P, ^' N: d
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附件里是原代培养第6天的细胞，传代后细胞状态太差，就没拍过照片了。) ?2 V, M' h8 U- m  _0 O
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实验时间紧迫，非常着急，大家交流一下啊。

饶冠华

神经细胞没有培养过  不过关于你贴壁的问题  你为什么不用低粘附板培养呢？corning有卖的啊   或者用HEMA处理过的培养瓶培养  这样细胞就不会贴壁的  像你说的那样培养  细胞都聚集在一起 等细胞长得多的时候  估计都容易导致下层细胞缺氧

ziyunfei1982

平放可以啊，不贴壁的，用小培养瓶，25的。不用3天换一次液，种完细胞等7天传代的时候看就可以了。没问题的。。传代的时候吹的温柔点。我吹成单细胞都没问题。随着传代次数增加成球能力会下降。但是可以传15代以上，传代次数多了不敢保证质量了。

qyguoguo

1.建议取孕13到15天的胎鼠的皮质，处理如上，胎鼠的神经干细胞的活性个人感觉比新生鼠的要强很多。
) X; @0 q# k4 ^5 _/ ^2 i" |1 r2.这个细胞密度个人感觉有点少，我一般是1*106，但文献上是跟你相仿，可试行一下。我一般用的是50ML培养瓶竖着养，感觉贴壁较少。都是自我感觉啊。。。! h8 t' T8 i" ]
3.培养基试过加谷氨酰胺吗？自我感觉加一点会好一点。吹打时尽量温柔。我使用胎鼠的皮质原代培养第二次传代的时候感觉细胞球还是可以的，个人认为，胎鼠的神经干细胞可能比新生鼠多一点吧，当然新生鼠没试过啊，瞎说的，你的新生鼠成球之后聚集在一起的可能祖细胞的比例大一些，过分的吹打可能造成细胞损伤的同时，祖细胞可能也会发生分化或凋亡。我传代的时候一般是按1：1，以前的时候也按过1：2，效果较差，现在做实验一般就取一小部分，神经干细胞的成球可能也是需要一定的密度依赖吧。
6 S' M1 K, |0 o" \" g, Y  以上都是个人实验琢磨的一些东东，也算是瞎说一通，望楼主不吝赐教啊。。。。

huangfei2010

回复 4# qyguoguo
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0 A7 C: c/ G; c0 n3 B个人感觉，在培养中，培养液的PH也很重要，我刚开始的时候配的培养液和楼主一样，用了一个星期就变的有的紫，还有我们用机械法传代吹打的时候特别容易是加到细胞里面的培养液变碱，吹打传代后加到培养瓶中的培养液还是桔红的，第二天就是紫红了，个人经验培养液稍微偏酸一点，7.0-7.4，在偏碱的培养液中，神经干细胞张的不好，感觉就不长，还容易分化

荤荤

非常感谢大家，听了你们的建议，我获益颇多，总结如下：0 ^( T0 ~+ F5 m' N: y( z
1.以前都没听说过低粘附培养板，不过好像费用太高了
8 \. l" X% W. u  p: F; z; ^2.我也考虑过用胎鼠，好像是胚胎干细胞具有较强的增殖能力，而成年鼠的干细胞多以不对称的形式分裂，形成一个干细胞和一个前体细胞，所以干细胞的密度就很难提升了，不过请问qyguoguo ，你是用胎鼠的全脑还是只用它的皮层？如果不是取全脑，为什么不取海马，而选择皮层呢？7 k$ o9 d- l. h' T4 D: v
3.关于1：1传代与1：2传代，个人也觉得前者效果更好，不过这也可能与我取的是新生鼠，干细胞增殖能力不够有关吧& _3 J3 x$ v4 Z" b" P3 W3 M% h
4.huangfei2010说的培养液变色的问题，我也有非常深的感受，无论我怎么用封口膜包好，液体很容易会变紫，之前要是颜色变化的不是很严重的时候我一般就将就着用了，这可能也是一大问题，下次一定要关注PH的情况。不过我想请问，我该用什么去调PH呢？把变紫的培养液PH调到你说的值，就可以继续用了吗？而且不影响培养的效果？

qyguoguo

1.不光神经干细胞用低粘附的，其他的如肿瘤干细胞也用啊，多查查文献吧，搞干细胞就是在烧钱，像我们这样的散户其实很多时候是在摸索性价比高的方法，呵呵呵，见笑。。。8 U1 N# I* a4 {8 v/ h$ K1 T6 B! z; V
2.取的是胎鼠的皮层。取海马？不知道阁下是否查过这方面的资料，我用的一般是孕13到15天的胎鼠，这个时间海马的解剖结构很不清晰，一般要到16天之后才会逐渐变得清晰，我取得时间较早，所以海马的没试过，呵呵瞎说的。。。
7 U3 j/ v- o3 {" d' P- u6 K0 V3.关于PH的问题，huangfei2010这位大侠说的很有道理，干细胞这东西对培养条件要求很苛刻，一不如意就死给你看，呵呵，通常在酒精灯上反复的烧瓶口会导致PH的剧烈变化，不光干细胞的培养液，其他类型细胞也如此，现在我们实验室很多兄弟姐妹都不用酒精灯了，但操作都很谨慎，污染的情况也没怎么发生，我没试过，总感觉风险有点大，怕污染，呵呵，瞎说的啊。其实DMEMF12的培养基中是添加了缓冲液的如HEPERS液，过长时间的存放是否会发生变化，阁下有没有试过再添加过呢，瞎说的。。。。
0 r/ G8 E8 {8 y    大家做实验都是不容易的，一起交流可能会是彼此少走一些弯路，但有些时候彼此的方法也不一定完全通用，可能参杂一些瞎说的成分，是否可行还请楼主不吝赐教。。。。。

qyguoguo

回复 5# huangfei2010
9 J6 [# e& Q$ X0 i1 n" I( J7 V/ |( F0 W2 ]9 Q

- f) @" |: W/ C7 d# K7 x/ i- u    大侠说的很对，干细胞嘛对条件的要求是很苛刻的，不像一般的肿瘤细胞，条件稍微改变他就会死给你看，呵呵，比孩子难养多了。玩笑的。PH值真的很重要，实验中晚辈也曾将遇到过这样的问题，不知大侠有什么高见，是否可不吝赐教，大家一起分享一下啊，期待中。。。。。

huangfei2010

回复 10# 荤荤 * r1 S: d; t' n' X' @

* R/ E" i3 A7 y0 x5 }4 K9 F我用的是0.5N的Hcl调节，感觉还行，用调了pH的培养液养了一段时间，对细胞影响不大，把颜色调成橘红就可以了，不放心的话可以用pH试纸检测一下，我感觉平放培养瓶的时候神经球贴壁的明显，我立着放贴壁的就少些，大家多多交流啊，我现在刚传了三代，都是用机械法传的，用吸管抵住离心管底部吹打，可以增大剪切力，细胞球大多可以分散成单个细胞，我一般都是传代后2天细胞就可以聚球了，不过随着培养时间的延长，贴壁的就多了。

ouyangjuan

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7 P" B# e1 c8 w; f  Q( Z0 O
这些文献可能对你的神经球培养有一定的帮助，有时间的话，可以看看！