碱性磷酸酶染色

郭小妹

请问固定的时间对染色结果影响很大吗？

majing217

先拿PBS23次，然后4%多聚甲醛固定30秒，PBS再洗3遍，之后加入碱性磷酸酶染液，孵育30分钟，就可以看结果了。

准姿梅影

学习了，非常感谢

dongxin

1. 按Vector blue Alkalin Phosphatase Substrate Kit III 配置反应液；2 I( q) x5 h; I& p/ p; q* B
2. 用PBS洗细胞2-3次；
7 \* V% E8 k9 e8 ^$ h  C2 m, W3 `# Q3. 将反应液加入培养皿中， 37°C 避光反应0.5-2h；% w& j( \/ C9 j, F1 B) A
4. 弃去反应液，用 100 mM Tris-HCl, pH 8.2 洗一次；0 Y" J) I5 n  O* i+ t
5. 加入PBS，在倒置显微镜下观察。
9 k9 h2 P/ n  N; W6 f, v9 J供参考，祝好运！+ u9 x1 b" r. z5 j

zsc78

回复 lianmudichui 的帖子
9 o  l. R: Z3 ~9 U: r; Z# J
6 V; M! O4 J: ^8 z) u' O$ }* HMillipore的ALP试剂盒

gact

回复 是鸟就要去飞 的帖子* T/ E9 k+ M/ I

1 @* c( i# t, c收集细胞是指用爬片做，还是要胰酶消化离心收集？

gact

回复 ouyangjuan 的帖子
. }5 H( ]2 {6 M: ^# u' ]. P  h- e3 L9 }
显色液成分是什么？？？* N" S+ |2 z: I* W9 N9 g5 ]6 b( p

lianmudichui

回复 zsc78 的帖子& |  `5 S7 P1 P- Q# O$ D

% |8 p" s9 Q& h" ^/ e) N你是用的试剂盒还是别的什么做的，详细步骤能告诉一下吗？谢谢

czzhaozhu

AKP染色具体步骤：* w& U3 H' g$ L0 w! |% g! [$ a( \
(1).        配制AKP缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，PH 9.5，50 mmol/L MgCl2，0.1% Tween-20）。5 w. q8 e8 T- F% R
(2).        从培养箱中取出生长5~6天的hESCs，弃去旧液，PBS洗两遍，加入含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛室温下固定30 min。' B. U7 Q& Y' s, _9 Q( H! o, [$ a
(3).        AKP缓冲液洗涤3次×10 min。
3 ^+ r" H+ \# u9 X3 u' R$ f(4).        配制新鲜的AKP染液：分别取45 μl NBT（nitroblue tetrazolium）染液和35 μl BICP（5-bromo-4-chloro-3-indolyphophate toluidinium）染液溶于10 mL AKP缓冲液中。
; G7 E, s0 e! @: r, [! e(5).        加入染液，室温避光作用约20 min，自来水显色，显微镜下观察。* V; H/ I; a- ]7 ^  P

rubyrobin

谢了，正 找着