明天做传代了。有人有失败经验分享吗？

crystal

我养的是HELA细胞，8号复苏的，9号我换了液，当时细胞死了很多，因为当时是我师姐帮我复苏的。$ ?' a% H( t8 v' `* S2 C4 V. x: R
我10号看细胞长了20%的样子，没换液，11号，细胞贴壁可能40%，然后我换了液，今天没有去看它，老师说让我明天去传代差不多了。
# Z0 w% f' S5 l  N( E( O; r3 S听一个师兄说他以前养细胞的时候，是从2个细胞开始养的，后来长得很好，传代的时候不知道杂的全死翘翘了。; n6 S3 d7 X& b0 e; l6 Z2 k
我好担心啊！! p+ x% R& S$ W/ o
我这问题对于懂的人来说，肯定和1+1=？差不多，但我本来就不懂嘛，不懂就要问---不耻下问！

crystal

楼上的哥哥写得好详细哦，我记下来了，打印出来做实验的时候对比做看了。谢谢了哈！

王乾

首先，冻细胞的时候一定要遵循慢冻的原则，一般为一分钟降一度为好。我一般是把冻存盒先放在室温一段时间，大概升到室温或低一些，再把装好细胞的冻存管放进去，盖好盖子，放到-80，三小时或过夜后转移到液氮或-150。还有，我一般喜欢提前配2*的冻存液，用起来方便。
) R9 G) r/ r3 \" u% v" \) p! i其次，复苏细胞时一定要速溶，从液氮中取出细胞，如果液氮罐离细胞房较远，可以把细胞放到冻存盒里带过去（切忌：此时的冻存盒一定是刚从-80拿出来的)。复苏时一般是把冻存管浸在37度水浴里，轻轻摇动冻存管，这样化冻的更快。化好后，把细胞转移到15ml的离心管里，加5ml的DMEM或PBS，1000rpm/min离心3分钟，去掉上清，培养基重悬，最后接到培养皿里。这一步如果没做好的话细胞会死很多，甚至全军覆没！！！- e/ w- E6 A' W1 w
另外传代的方法我也想说一下，我们一般是先用PBS把细胞轻轻冲洗一下，吸去PBS，然后加适量的胰酶，消化一定时间（不同细胞会差很多，一般为细胞刚从培养皿上脱落为宜），然后加一定量的DMEM（一定是含血清的，只有血清才能终止胰酶），此时细胞应该还是有一些大块粘连的，用1ml的移液枪轻轻吹打，原则是吹打成单细胞为止，自己最好积累点经验。然后把细胞转移到15ml的离心管中，1000rpm/min离心3分钟，去上清，培养基重悬接入培养皿。我对比过离心重悬和不离心直接传代，前者传代的细胞状态会好很多，细胞的状态对实验很重要哟。

fespysok

你复苏的Hela细胞冻存密度太低了吧！导致细胞长不起来，建议以后冻存密度达到1000000cells/ML ，避免复苏后细胞活力低

luoziwei

HELA细胞很好养，没必要太频繁换液，我每隔3天，就是每4天换一次，慢慢的就“嗖嗖嗖”的长上来了。传代的时候，使用0.25%Trypsin-0.05%EDTA消化60s就够了，消化过度对子代细胞贴壁生长不好，还经常出现明亮的死细胞或是一些悬浮物。吹打的时候尽量多加些培养液，4-5ml差不多吧，还有就是太使劲以免出现太多气泡。希望对你有用。

crystal

都养细胞的，以后多多交流哈，应该是多多指点我哦！

english6

就是冻存方法的问题，我的也是刚复苏不久，要带本科生做实验呢
0 u7 K. l1 j4 r) A  I% D+ H刚复苏必然有死亡的9 R( a8 m; ~9 |' r/ R+ H; O
但是海拉细胞一般的传代养，没问题的，本科生就能做的了
$ _( F! y6 X, i# a' j还是看些这方面的文献好一些

crystal

谢谢楼上这两位大哥！我记下来了！

jhu132llh

海拉细胞好长的
$ h6 B/ D. p% d5 ]" p/ k不用着急滴
) P) ^" s9 r8 K* K. @- c冻存复苏死很多的话，就得注意冻存方法和冻存条件是不是没问题哦
/ T; M' a. Y; R) s解决一下这个问题吧/ r( G, \& @1 c% }4 [
要是每次冻存复苏都死很多的话，也是很麻烦的哦

crystal

今天本来打算传代的，可细胞才长70%，同学建议明天再传，哎！为什么我的细胞长得这么的慢哟！