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明天做传代了。有人有失败经验分享吗? [复制链接]

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楼主
发表于 2010-11-13 21:48 |只看该作者 |正序浏览 |打印
我养的是HELA细胞,8号复苏的,9号我换了液,当时细胞死了很多,因为当时是我师姐帮我复苏的。
5 I: J  v, v+ H- T! q; M我10号看细胞长了20%的样子,没换液,11号,细胞贴壁可能40%,然后我换了液,今天没有去看它,老师说让我明天去传代差不多了。, J7 \; l* z" n" C- x: {
听一个师兄说他以前养细胞的时候,是从2个细胞开始养的,后来长得很好,传代的时候不知道杂的全死翘翘了。* ~) x+ @# A. O& l9 H" X, Y. }
我好担心啊!. z, w( z! L3 `+ c# @
我这问题对于懂的人来说,肯定和1+1=?差不多,但我本来就不懂嘛,不懂就要问---不耻下问!
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发表于 2010-11-15 20:56 |只看该作者
楼上的哥哥写得好详细哦,我记下来了,打印出来做实验的时候对比做看了。谢谢了哈!

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发表于 2010-11-15 17:07 |只看该作者
首先,冻细胞的时候一定要遵循慢冻的原则,一般为一分钟降一度为好。我一般是把冻存盒先放在室温一段时间,大概升到室温或低一些,再把装好细胞的冻存管放进去,盖好盖子,放到-80,三小时或过夜后转移到液氮或-150。还有,我一般喜欢提前配2*的冻存液,用起来方便。2 `' x, P6 }; `) G" C
其次,复苏细胞时一定要速溶,从液氮中取出细胞,如果液氮罐离细胞房较远,可以把细胞放到冻存盒里带过去(切忌:此时的冻存盒一定是刚从-80拿出来的)。复苏时一般是把冻存管浸在37度水浴里,轻轻摇动冻存管,这样化冻的更快。化好后,把细胞转移到15ml的离心管里,加5ml的DMEM或PBS,1000rpm/min离心3分钟,去掉上清,培养基重悬,最后接到培养皿里。这一步如果没做好的话细胞会死很多,甚至全军覆没!!!% r, U) T. F( ?, J" V; l* Q
另外传代的方法我也想说一下,我们一般是先用PBS把细胞轻轻冲洗一下,吸去PBS,然后加适量的胰酶,消化一定时间(不同细胞会差很多,一般为细胞刚从培养皿上脱落为宜),然后加一定量的DMEM(一定是含血清的,只有血清才能终止胰酶),此时细胞应该还是有一些大块粘连的,用1ml的移液枪轻轻吹打,原则是吹打成单细胞为止,自己最好积累点经验。然后把细胞转移到15ml的离心管中,1000rpm/min离心3分钟,去上清,培养基重悬接入培养皿。我对比过离心重悬和不离心直接传代,前者传代的细胞状态会好很多,细胞的状态对实验很重要哟。
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发表于 2010-11-15 15:50 |只看该作者
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你复苏的Hela细胞冻存密度太低了吧!导致细胞长不起来,建议以后冻存密度达到1000000cells/ML ,避免复苏后细胞活力低
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发表于 2010-11-15 14:28 |只看该作者
HELA细胞很好养,没必要太频繁换液,我每隔3天,就是每4天换一次,慢慢的就“嗖嗖嗖”的长上来了。传代的时候,使用0.25%Trypsin-0.05%EDTA消化60s就够了,消化过度对子代细胞贴壁生长不好,还经常出现明亮的死细胞或是一些悬浮物。吹打的时候尽量多加些培养液,4-5ml差不多吧,还有就是太使劲以免出现太多气泡。希望对你有用。
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发表于 2010-11-14 19:13 |只看该作者
都养细胞的,以后多多交流哈,应该是多多指点我哦!

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地板
发表于 2010-11-14 16:47 |只看该作者
就是冻存方法的问题,我的也是刚复苏不久,要带本科生做实验呢
* q. G( G! c- X/ V, ~4 G) [. i! I刚复苏必然有死亡的
/ j* K. s7 ]  r6 n6 j5 x但是海拉细胞一般的传代养,没问题的,本科生就能做的了
9 Q! u' h+ G; l6 z7 I5 A还是看些这方面的文献好一些
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报纸
发表于 2010-11-14 13:25 |只看该作者
谢谢楼上这两位大哥!我记下来了!

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板凳
发表于 2010-11-14 12:10 |只看该作者
海拉细胞好长的
" n3 E1 @( l* B! s不用着急滴. L& ]8 B# s0 Z. `" B$ q5 O
冻存复苏死很多的话,就得注意冻存方法和冻存条件是不是没问题哦; W/ g4 `$ ~/ v  s" Q" ?$ i0 |
解决一下这个问题吧, U5 c1 S6 f+ u' P5 R& B$ w  N
要是每次冻存复苏都死很多的话,也是很麻烦的哦
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藤椅
发表于 2010-11-14 11:00 |只看该作者
今天本来打算传代的,可细胞才长70%,同学建议明天再传,哎!为什么我的细胞长得这么的慢哟!
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