胰酶消化传代需要注意什么问题？

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我养的是兔BMSCs，要进行传代了，向各位高手求助，0.25%的胰酶一般用量是多少，我用的培养瓶是25cm2，时间多长，估计什么时候开始停止消化，停止消化的方法是什么，用不用离心，请各位帮个忙，谢谢了！

yuhaoze

用胰蛋白酶注意时间就可以，操作步骤可以是这样的：先取出旧的培养液，加入0.2ml的胰蛋白酶，洗涤瓶底，去除残留培养液，吸出。再加入0.5ml胰蛋白酶消化1min左右，吸出，加入新培养液终止消化。反复吹打传代。其实具体的时间还要看你细胞的状态，如果是对数期的就比较容易传代，消化短一点时间，如果细胞贴避较强，就多消化一会儿，要是hela细胞，我一般就不加胰蛋白酶，直接吹。

hormone008

建议你，最好温浴一下酶
& H- l6 l+ C7 R5 X4 x- W) j用量：500ul

luoziwei

T25的 flask加1ml 胰酶就行了，但你说要用0.25% Trypsin的话，这个浓度有点高，在很短的时间内就能使细胞漂浮起来。所以建议先稀释5倍，慢慢调适胰酶的浓度。我用的是0.08%的胰酶，消化3min就行了。

mhy1982

25cm2的瓶我一般加0.5ml的0.25%的胰酶就可以了，胰酶用前要在37℃下水浴，保证效果。消化前细胞要用PBS洗2遍，然后加入胰酶，这时如果细胞的代数比较靠前，可以在显微镜下观察，细胞很快变圆，这时就可以轻轻震荡拍打养瓶，见细胞大部分离开瓶底，就可以加入培养基终止消化，如果细胞代数靠后，不太容易消化，就放在培养箱1-3分钟，然后观察到细胞变圆就可以终止消化。我一般不离心，加入的培养基量远远大于胰酶量就可以等细胞贴壁后换液。也可以离心后重悬然后接种。

goodyezi

胰酶可以浸润瓶底就可以了，消化之前用PBS清洗一下，以免残留的培养液中的血清影响消化，消化的时候可以借助显微镜观察，胞质回缩，部分细胞漂起，就可以终止消化了，用新的培养基，或者在PBS中加入血清作为终止液。消化时间不宜过长，否则影响细胞贴壁。

fespysok

25cm2的培养瓶加入1ml胰酶消化，可放入温箱孵育几分钟，待细胞回缩弃去胰酶，再孵育至细胞呈圆形时，加入含血清的培养基终止胰酶消化

daviddow

PBS洗2遍，就用你那个0.25%胰酶，看到细胞都漂浮下来后，加入同样体积的培养基，离心就可以。

yuhaoze

楼上那么弄，你细胞死不死

masl

就是呀，细胞全下来就完了。每个实验室的胰酶活性都不一样，把胰酶稀释一下，不能刚刚加胰酶细胞就下来了。消化时间自己慢慢试吧，每隔几十秒观察一下，当敲动载物台时有很多细胞在晃动，就可以终止了。终止用的是你刚刚从瓶中吸走的培养基。PBS冲洗两遍。我没养过BMSCs，如果像MEF之类是单个细胞的话就1200rpm离心5min。