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作者：胡忠浩，王珊珊，徐铁军 ; T ~( w: D& J9 o
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【关键词】神经干细胞;NMDA受体亚单位2B;Western,blot
* @3 u3 |+ j6 ~2 o4 H 摘要 :目的研究离体培养的大鼠神经干细胞（NSCs）中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚单位NR2B的表达。 方法从孕18～19天胎鼠海马中分离、培养、传代、鉴定NSCs，用免疫细胞化学、Western blot免疫印迹检测传代1次NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的表达。 结果源自孕18～19天胎鼠海马的NSCs，即可以表达NM-DA受体亚单位NR2B。 结论体外培养的NSCs能表达NMDA受体亚单位NR2B。7 Q" N* v* @) W
关键词 :神经干细胞;NMDA受体亚单位2B;Western blot) _2 a" ]9 K/ L$ p- W K: G
The expression of NMDA receptor subunit2B in neural stem cells in vitro b, F) V8 q1 G) x5 b. b
HU Zhong-hao，WANG Shan-shan，XUTie-jun6 P) V- R. E* s
（Department of Anatomy and Neurobiology，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China）
; n3 K& y. A0 [0 K6 {. u/ Q6 R5 jAbstract:Objective To investigate the expression of NMDA receptor subunit2B in the cultured neural stem cells（NSCs）.Methods NSCs from the hippocampus of rats at embryonic day18-19were isolated，cultured，passaged and identi-fied.The expression of N-methyl-D-aspartate（NMDA）receptor subunit2B in the passaged NSCs was determined by im-munocytochemistry and Western blot.Results It was found that NSCs derived from the hippocampus of rats at embryonic day18-19could express NMDA receptor subunit2B.Conclusion NSCs can express NMDA receptor subunit2B in vitro.
; H( w \" W) c( q! UKey words:neural stem cells;NMDA receptor subunit2B;Western blot* p7 F! M8 v* w9 h9 C" U
自20世纪90年代以来，人们相继从哺乳动物中枢神经系统内，特别是成年人脑脑室周围的室管膜下层、齿状回颗粒下层、纹状体等部位分离培养出 神经干细胞［1］ （neural stem cells，NSCs）。NSCs的生长及分化与多种神经生长因子和神经营养因子有关，其中谷氨酸及其受体起着重要的作用。谷氨酸是体内一种主要的兴奋性氨基酸，它的过度释放可通过NMDA受体导致神经元和神经胶质细胞的死亡［2］ 。已有研究表明，在体外培养的神经元上表达N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体［3］ ，那么NSCs是否表达NMDA受体，其对细胞会产生何种影响还不是很清楚。本实验初步研究了NSCs上NR2B的蛋白质的表达。# ?0 J5 r, D4 g# p
1 材料和方法/ q8 Y H. y6 c( T9 c
1.1 材料孕18～19天SD（Sprague-Dawley）大鼠由徐州医学院实验动物中心提供。& g3 l2 T Z% T' p1 k
1.2 主要试剂和仪器细胞培养试剂高糖DMEM.F12（1∶1）、B27、重组人碱性成纤维生长因子（h-bF-GF）、重组人表皮生长因子（h-EGF）均购自Gibco公司。抗体为:神经上皮干细胞蛋白（nestin）单克隆抗体（Sigma公司）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）单克隆抗体（Sigma公司）、β-Ⅲ型微管蛋白（β-Ⅲtubu-lin）单克隆抗体（Sigma公司）、山羊抗NR2B多克隆抗体（Santa Cruz公司）、生物素标记兔抗山羊IgG和羊抗小鼠IgG（北京中杉生物试剂公司）、碱性磷酸酶标记兔抗山羊IgG（北京中杉生物试剂公司）、兔抗山羊FITC-IgG（Jackson Immono Research公司）、山羊抗鼠TRITC-IgG（Jackson Immono Research公司）、山羊抗鼠FITC-IgG（Jackson Immono Research公司）。DAB（北京中杉生物试剂公司），多聚赖氨酸（Sigma公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物试剂公司）。仪器:CO 2 培养箱（Thermo，美国），荧光倒置相差显微镜（Olympus IX70，日本），Mini-PROTEAN3Cell（BIO RAD，美国），分光光度计（722N，上海），低温高速离心机（Eppendorf，德国），蛋白质转膜仪（BIO RAD公司）。
( i; T. l5 L# y* |+ ~7 B+ g8 f 1.3 方法& s/ t+ A0 h0 `" P( ]5 k) P2 \
1.3.1 大鼠胚胎NSCs的分离培养 取孕18～19天大鼠，麻醉后处死，消毒取胎鼠，将胎鼠置于0.5%碘伏中消毒，取脑，分离海马，置于盛有少量高糖DMEM.F12基础培养液的培养皿中;将组织尽量剪碎，加入基础培养液5ml，吹打制成细胞悬液，400目筛网过滤，台盼蓝染色，细胞计数，以2×10 9 个细胞.L接种到6孔培养板内，最后加入h-EGF（20μg.L）和h-bFGF（20μg.L），置37℃、5%CO 2 、95%空气、平衡湿度培养箱中，倒置显微镜观察。每7～10天传代1次。! { ] H2 Y7 A9 L) }# e; f5 u& z: }
1.3.2 NSCs的nestin鉴定 取传代1次的神经干 细胞球种于铺有多聚赖氨酸（100mg.L）的24孔培养 板中，4h后行间接荧光免疫细胞化学染色:①4%多聚甲醛固定10～15min;②0.01mol.L PBS洗5min×3次;③10%羊血清37℃孵育30min;④加入抗nestin（小鼠单抗1∶500），4℃过夜，阴性对照组仅加一抗稀释液0.01mol.L PBS，其余步骤相同;⑤0.01mol.L PBS洗5min×3次;⑥加山羊抗鼠FITC-IgG荧光二抗（1∶200），37℃，1h;⑦0.01mol.L PBS洗5min×3次，倒置荧光显微镜观察拍照。
9 Z' [+ j0 {! R P n1 F: d1.3.3 NSCs的诱导分化及其鉴定 将传代1次的神经干细胞球和培养液移入离心管，离心去除旧培养液，加含1鸖的DMEM.F12，种于铺有多聚赖氨酸（100mg.L）的24孔培养板中，于12h～14天时，行免疫细胞化学反应:①4%多聚甲醛固定15min;②3%过氧化氢封闭15min;③10%羊血清37℃孵育30min;④分别加入抗β-Ⅲtubulin（小鼠单抗1∶1000）或抗GFAP（小鼠单抗1∶500）抗体，4℃过夜，阴性对照组仅加一抗稀释液0.01mol.L PBS，其余步骤相同;⑤加生物素标记羊抗小鼠IgG，37℃，30min;⑥加辣根过氧化物酶（HRP）标记的卵白素-生物素复合物;⑦DAB.过氧化氢（0.05%.0.01%）呈色，倒置显微镜观察拍照。除血清和一抗之间外，其余各步间均以0.01mol.L PBS洗5min×3次。藉此区分神经元、星形胶质细胞，以鉴定NSCs的多分化潜能。
! ]: w+ B4 o9 x5 ]0 g7 f1 V* c1.3.4 免疫细胞化学法检测NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的表达 取传代1次的神经干细胞球种于铺有多聚赖氨酸（100mg.L）的24孔培养板中，4h后，用NR2B（羊多抗1∶200）抗体行免疫细胞化学反应，步骤同上。0 w, J6 ?- p( e+ o: D
1.3.5 Western blot免疫印迹法检测NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的蛋白表达 ①取传代1次的神经干细胞球，用PBS离心洗3次，离心后沉淀加入200μl匀浆液，在超声匀浆机中匀浆;②应用改良Lowery法测定蛋白浓度，然后加入蛋白变性剂煮沸5min，冷却后-20℃保存;③配制7.5%的SDS-PAGE胶，每孔上样50μg总蛋白，200V电泳1h，然后用湿转仪将样品转移到硝酸纤维素膜上;④室温封闭6h，然后加入抗NR2B（兔多抗1∶200），4℃过夜。第2天加碱性磷酸酶标记兔抗山羊IgG（1∶1000）室温反应2h;⑤用NBT-BCIP显色。
) i; _. p* ~" _. |; i0 }5 M9 h A1.3.6 NSCs诱导分化后NMDA受体亚单位NR2B的表达鉴定 取传代1次的神经干细胞球种于铺有多聚赖氨酸（100mg.L）的24孔培养板中，加含1鸖的基础培养液，于7天时，行抗NR2B（羊多抗1∶200）和β-Ⅲtubulin（小鼠单抗1∶1000）免疫荧光双标化学反应:先加入NR2B的一抗和兔抗山羊FITC-IgG（1∶200），再加入β-Ⅲtubulin的一抗和山羊抗鼠TRITC-IgG（1∶200），步骤同上。3 M! K8 i" }* x
2 结 果! M" ?0 W3 v8 u
2.1 NSCs的培养与鉴定细胞培养2天后，细胞均以单个细胞或小细胞簇的形式分布在培养液中，细胞呈圆球形，折光性强，部分贴壁但未见细胞突起伸出，换液后继续培养，细胞形成大量的细胞球悬浮在培养液中（图1）。未诱导分化前，悬浮细胞nestin荧光免疫细胞化学染色阳性（图2）;诱导分化后的细胞β-Ⅲtubulin（图3）、GFAP（图4）免疫细胞化学染色阳性。
0 K2 G3 h3 c u7 @2.2 NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的免疫细胞化学鉴定培养的NSCs球行免疫细胞化学鉴定后显示有NR2B的阳性表达（图5、6）。# i6 Y7 ]" @0 x" {, A
2.3 NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的蛋白表达培养的NSCs球进行Western blot免疫印迹检测，显示有NR2B阳性条带的出现（图7）。" w' R7 P: x) S; x. l. S
2.4 NSCs诱导分化后NMDA受体亚单位NR2B的表达鉴定NSCs诱导分化7天后，免疫荧光双标显示β-Ⅲtubulin（图8）和NR2B（图9）反应阳性，即分化形成的神经元能够表达NR2B。
` q2 }7 m& E% h/ f/ k7 u: q 3 讨 论
( n, B- y* U" v5 Q2 E9 k9 C) m; ~NSCs是一种具有生长和分化潜能的神经祖细胞，在一定条件下能增殖分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。Gage［1］ 将神经干细胞概括为:可生成神经组织或者来源于神经系统，具有自我更新能力，能通过不对称细胞分裂产生新细胞。NSCs生物学特性的研究有可能带来关于神经系统发生、发育和再生基本理论更大的突破性进展，同时NSCs本身也有可能成为临床上细胞移植、基因治疗和替代疗法的主要来源和载体。1 h# g; ]$ i9 J- Q
NMDA受体是哺乳动物中枢神经系统内主要的兴奋性氨基酸受体之一，参与中枢神经系统许多重要的生理和病理过程［4］ 。NMDA受体属配基和电压双门控的Ca 2 离子通道，现已发现并克隆出的NM-DA受体亚单位有NR1、NR2（包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D4种）、NR3和NR4亚单位［5］ 。NR1在中枢神经系统内广泛分布，是NMDA受体必需的亚单位;NR2、NR3和NR4则呈特异性分布［6-7］ 。NMDA受体在不同脑区可以由不同的亚单位组成，并产生不同的电生理学及药理学特性［8］ 。
# h5 j, ?4 y" z5 [近年有研究表明，在体外培养的神经元上，NM-DA受体不同的亚单位在发育的不同时期位于不同的部位，发挥不同的作用。定位于突触上的NMDA受体所引起的钙离子的流动，导致突触效能的改变，促进了细胞的存活;而突触外的NMDA受体所引起的钙离子的流动与细胞死亡相关［9～11］ 。那么NSCs在未形成突触前，是否表达功能性NMDA受体，其对细胞会产生何种影响还不是很清楚。另外，在成年大鼠海马分离培养的神经前体细胞中发现NR2B mRNA有表达，且持续接触低剂量NMDA会抑制神经球的形成，并使其易于向神经元分化［12］ 。因此，功能性NMDA受体可能在神经前体细胞分化为神经元之前就已经表达。但有关NSCs生物学性质的一些问题还不是很清楚［13-14］ ，譬如，NSCs体外长期培养中和加血清诱导分化时，NMDA受体及其亚单位的表达与功能状态如何?: e Y* D/ A; p% F8 }. V
本实验中我们运用免疫细胞化学、Western blot技术检测了NSCs中NR2B的表达。我们选取传代1次的NSCs球，免疫印迹结果显示，NSCs有NR2B蛋白质的表达，并且免疫细胞化学反应呈阳性。+ O8 s9 f* t# U0 j8 L
试验结果显示在NSCs阶段就有NR2B的表达，且分化为神经元后依然表达，说明NSCs有可能对谷氨酸起反应，NMDA受体与NSCs的增殖、分化可能密切相关。有实验报道，NMDA受体的活化对从成年大鼠分离出的神经前体细胞的定型和分化起到重要作用［12］ 。另外，不论在离体或在体情况下，Cav1.2.1.3通道和NMDA受体介导的兴奋性刺激可以增加由增殖期成年大鼠神经前体细胞分化成的神经元的数量，但不影响前体细胞自身的增殖率、存活和凋亡13］ 。因此，本实验为进一步研究NMDA受体亚单位的功能及NSCs的临床应用打下了扎实的理论和实验基础。下一步我们将继续研究NMDA受体NR1和NR2A的表达以及NMDA受体在NSCs增殖、分化中的作用。
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（徐州医学院人体解剖和神经生物学教研室，江苏徐州221002） |
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发表于 2009-3-3 12:31
发表于 2015-5-26 11:44
