染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~

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革兰氏染色  W: i" d4 t8 P
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革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。# E* O+ j8 c, |
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方法简介
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　　是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram，1853年－1938年）于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。
, P0 k* R5 F3 X& g　　未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。: ?" b/ i4 q" ?9 X& W* F9 c1 p
　　原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
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6 }0 Y9 P; s. _/ \1 d. q* L- k常见致病菌( N8 K2 a/ ?2 ~$ t, K/ l/ j

1 l9 _7 c& Z$ j4 s9 k　　金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等 属革兰氏染色阳性菌。3 V4 ?+ T7 K3 z/ t- b6 I3 R+ U
　　百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等 属革兰氏阴性。
: |  F. q% h7 [　　所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。
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实验方法' [5 J* _# T/ w8 B7 [" p% r6 B
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步骤. j+ u7 a  h7 C- l, U* F: m
　　革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：+ N# V) y3 x7 H
　　1）涂片固定。
/ K# V8 b' J9 |3 u6 k　　2）草酸铵结晶紫染1分钟。5 N+ \& U/ k5 M0 A% c- o
　　3）自来水冲洗。" f+ V; t: Q1 v) C2 L5 w
　　4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5 d" P7 L% [* {, ?2 W$ ]0 ]　　5）水洗，用吸水纸吸去水分。1 p8 N$ h+ x  }- _0 i
　　6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
, B7 Z2 ?2 I2 z　　7）蕃红梁色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
; }/ i% n2 R& Z/ }6 b+ Z& T2 L5 _0 i原理6 u# Y1 w6 V. R3 @/ a' m
　　通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。3 X" u! Q9 b7 ^1 J5 H: H
染色结果
: `' ?0 J1 G# K4 p& G3 ^　　革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。
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临床意义
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2 W8 {% T- k8 M' T- S  d　　其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌 2.选择药物 3.与致病性有关：：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。
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9 `+ n6 M' ]# s7 c特性
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* n0 P& L5 M/ B; Z　　染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用龙胆紫染色，加碘液媒染后用酒精脱色，再用蕃红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G+）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（G-）。革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、碳疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。( Q4 e0 E3 h# ^0 {5 B. O  j0 ?
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鉴定原理
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　　  6 `* ^. m" C  U' R9 h
革兰氏染色2 _4 @  y( q/ F' Y3 _9 ]' h" a# F% y
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。. z5 x& w* T! ~

1 |! {3 l4 [% a8 l7 C0 t实验流程/ H& _. h$ Y/ y# q1 c4 z+ f

) l9 c3 ^6 B$ |　　1、 取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。; s' G/ J( E: s( }
　　2、 涂片：
; u" R( X, n% p& N7 z0 |: C  U; G　　液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
$ f/ n: @9 s3 t5 a% i　　固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
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. D7 K4 b5 @# B" }# l1 _3 d. k革兰氏染色
4 J# d. i6 o, t5 K; V1 n1 p6 A3、 晾干：让涂片在空气中自然干燥。
. l% J# l7 @, ?7 p6 {　　4、 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
( H8 S' m4 u1 D% b4 e& V　　5、 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。/ e# ]8 ~: o7 ]! D% o6 N' A
　　6、 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。/ r* t$ w$ u! ~- |  N- o; l: A, D
　　7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。- N3 D' M! D: O
　　8、 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
3 k) N+ N, K  N$ s9 C　　9、 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
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可能误差
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2 [# q9 c1 m- }& K+ C: ?　　在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。

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结晶紫 Crystal violet0 e$ G) a1 H& t' }* }
别名：甲基青莲；甲紫；Hexamethylpararosaniline chloride; Gentian violet' I) H, M1 X: B) Z
分子式：C25H30ClN3& V9 |6 r$ c7 ~% Q, P  ]5 }* F
相对分子质量：40799
% s1 _3 }, k- V# r! m3 U) _/ g性状:具有金属光泽的暗绿色结晶形粉末。熔点为215℃（分解）。溶于水、乙醇和三氯甲烷，溶液呈紫色。不熔于乙醚。浓酸中呈黄色，当pH值增大时其颜色变化是黄→绿→蓝→紫。与Sn4＋、Tl3＋、Au3＋和Sb3＋的卤络阴离子及MoO 、ReO 等形成缔合物，能被苯、甲苯等有机溶剂萃取。在溴蒸气存在下，试剂与类脂质产生蓝色物质（黄色背景）。
. k0 Z5 K$ r4 t) r" o, T* d用途：用作酸碱指示剂，pH值0.15（黄）～0.32（绿），pH值1.0（绿）～1.5（蓝），pH值2.0（蓝）～3.0（紫）。用于非水滴定。还用于光度法测定硼、锑、铼、铊、钽、金、钨、锌、镉、汞等的离子缔合剂。并用作生物染色剂及用作薄层色谱法测定脂质的试剂。

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过氧化物酶染色
& L4 p! U0 n) R3 R# kperoxidase ,(POX)2 K% I  i5 _3 k

0 h) e7 W, ^4 v. u' `' [原理：
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: B* ^$ T7 k) C4 }    在血液和骨髓细胞中，粒细胞系和单核细胞系的嗜苯氨蓝颗粒 ("A"颗粒)内的溶酶体中存在有过氧化物酶（POX）。通过此酶氧化过氧化氢，释放出单原子氧，后者氧化3-3二氨基联苯胺，使之变成棕黑色颗粒状沉淀物，定位于酶活力所在处。由于各种细胞内过氧化物酶（POX）的活力不同，其颗粒大小与色泽深浅也有所不等。此酶的活性与溶酶体的数量有关，而与嗜苯氨蓝颗粒（"A"）颗粒的多少无关。淋巴细胞质嗜苯氨蓝颗粒中不存在溶酶体，所以过氧化物酶染色呈阴性反应，正常人群中性粒细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞呈阳性反应。淋巴细胞、巨核细胞、红细胞、浆细胞等均呈阴性反应。
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正常细胞反应:
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! _8 M) w# h( c8 w) ]" |0 f1. 粒细胞系---各阶段中性粒细胞（少数原粒除外）可呈颗粒状阳性或强阳性。定位于胞质内。嗜酸性粒细胞可呈均匀粗大颗粒状阳性。定位于胞质内。8 ?6 m' F- y9 H, G( w
1 }2 Z( \  P) w5 w- D- x
2. 单核细胞系-成熟单核和幼稚单核及部分原始单核(分化较好)可呈弥散细颗粒状阳性, 定位于胞质内。
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& B9 \4 c2 v& S. e" m, t3. 红细胞系、淋巴细胞系、巨核细胞系、浆细胞系---均呈阴性。
3 T$ B( n( E, p4 \& K0 x, Q) x- p7 M6 Q% W
病理变化：
: l' \* L0 }8 E1 U4 ]7 f# |4 ]$ H7 p" ~, I, |2 l- \' H  b
1.酶活性增高可见于再生障碍性贫血、急性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、放射病、嗜碱粒细胞在慢性粒细胞性白血病时可出现阳性。& {" `( L' U" L! x% W3 Q4 K# w# M9 N

7 E7 ?9 |3 i5 a+ ~3 _' @0 B: y$ J2. 酶活性减低可见于某些肿瘤、MDS、链球菌感染、风湿热等。
3 A' l- N- b  E/ ?1 V
7 e4 z/ |& q, X: @& c0 Y) @% t; u3. 酶活性缺乏可见于：4 u6 F" R; L/ G2 S8 v: i1 G! w
8 m  t7 ~8 W8 }
a.(MPO)髓过氧化物酶缺乏引起中性粒细胞和单核细胞POX呈阴性,仅在涂片中见少数早幼粒细胞呈弱阳性反应。' E7 m9 a# i7 ^
# w% O2 b; t% ]6 v9 [2 S
b.乳过氧化物酶缺乏引起的嗜酸粒细胞POX呈阴性。' S% j; k4 y' k- Q$ z" B7 M
/ h+ l# H+ N  _  _) e
临床评价:
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1. 通常将其染色阳性率3%作为淋与非淋的分界标准。但需注意在淋巴细胞白血病时原始粒和单核细胞有时也会超过3%, 此时应慎重考虑, 结合形态反复观察。
2 a3 d  _  T& E/ _$ D& s( _' f% E/ U# ]- U) d
2. 若POX染色阳性且强度较高可结合细胞化学染色、细胞免疫表型检测, 遗传学和分子生物学检测对各种急性髓性白血病进行分型或亚型间的区别, 特别有助于M1与M5a、M2b与M3b及M4型亚型的鉴别。
4 R% m, `: v4 U/ V. B6 n4 }) j7 m4 G  {1 m- S) i
3. 若POX染色呈阴性反应, 必须结合其它细胞化学染色、细胞免疫表型, 遗传学和分子生物学, 来加以区分出淋巴系、非淋巴系、双表型、干细胞型等恶性增生。并对Mo与L3、M5a与L2、干细胞白血病与L3等进行诊断及鉴别诊断。+ w, l  P  V) z+ c4 m4 [

) Z. ^# J1 K" K# r9 P/ x操作步骤:
+ Z0 V& B7 S3 X1 k; S
6 Q$ w/ f1 o* _$ S% ]3 z    将新鲜涂片滴加POXI液数滴（覆盖血膜为宜），室温放置1分钟，勿冲洗即滴加POXII液数滴(与Ⅰ液等量)，可用洗耳球轻轻将二液充分混匀后置室温5分钟，随后用流水冲洗3～5分钟。再滴加95%乙醇脱色约2～3分钟，至涂片呈淡红色。水洗后以瑞氏染色液复染10～15分钟，水洗待涂片干燥后镜检并观察结果。
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! T" f6 r! ]+ z1 g1 i! q结果显示：) k1 b, p! Y: C1 ~7 d" B
& r; O  R8 v* p* ]8 y' t
阴性 —（﹣）胞质内无色。( d& k9 Z/ f. L# G* V

9 f5 b9 N; t0 N+ `阳性 —（+）胞质中见棕黑色颗粒，呈局灶性分布。3 L) V$ Y# R- ]$ T

4 g' K5 e0 V$ o( @" B/ J% Q（++）胞质中见粗大、密集、分布较广的蓝黑色颗粒。
' G& V- k; \- R; A6 J4 m
0 K2 L) p# ^, E, v* g3 ?（+++）胞质中几乎布满大量粗大、成团块、蓝黑色颗粒。
) y: [2 V- o4 b4 J0 i9 j
6 A6 D( t$ u" g（++++） 胞质中充满粗大团块状蓝黑色颗粒并可覆盖于胞核上。位于胞质。2 t  T0 e5 r; H7 j  Y. d2 f
) I7 [/ J5 c& B
注意事项:
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1. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。
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2. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。- B% }0 O# \' H3 v

3 H% @8 x1 o1 d4 x0 a常见问题与解决方法：- ~3 s( J3 L4 C1 C4 X
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常见问题
  \! Y6 Z. f0 F' ~- t3 l( W原因! J: h  {; Y7 {  Z8 w% z
解决方法3 V' ~4 a0 G3 B! o- L/ n' X  v& O. V$ D) Z
未见阳性或阳性减弱：
0 r- Y. l2 A# |; j试剂盒过期太久         从新购买试剂盒
1 [- A6 v5 G$ q载玻片未洗净标本被污染         取干净玻片从新采集标本
+ {* i. ?+ D) J# e标本放置时间过久         从新采集标本
8 H6 v% J/ e4 A$ R6 y- s3 d标本沾遇其他化学物质特别是甲醇、过碘酸、盐酸等         采用未被污染的标本重新染色* F' x/ e  P3 G1 g
试剂滴加量太少或滴加后沿载玻片边沿流失        可重新滴加试剂. I$ u- O, J4 [' e
试剂启用后保存不当特别是Ⅱ液         换新试剂或Ⅱ液- m, \7 ~  p( d+ R) o& Y" X
使用了加有抗凝剂的标本         从新采集标本
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染色背景太复杂：
/ V8 p8 t9 G3 G% l- e采用了溶血的标本         采用未溶血的标本重新染色
( }. |, M7 ^/ f: G8 Q: W! Z推制标本时用力过猛造成细胞破裂         从新采集标本9 O* i, V: f8 H; G* ^2 N* p
部分白血病细胞易破碎特别是M3型白血病细胞        无法去除
! Q/ B" ]$ v7 r  b6 Z/ X* N, y4 p染色及复染后水洗时间不够或冲洗         通常水洗时间为2～3分钟而且
3 K1 W# J0 B" ]7 W, B方法不当        不能先倒掉复染液，须连染液一起冲洗

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中性粒细胞碱性磷酸酶染色/ V5 Z6 H8 N* Z
Neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP)% j$ {, A" j! E" k  m, e* v6 [
4 y0 J- z- F- K% W# ]' C
原 理：
/ P: s$ q- t, `5 Y4 ~) U( m6 a. m
" v% M, |8 n0 i  l& c$ m中性粒细胞内的碱性磷酸酶（NAP）在碱性环境下，水解α-磷酸萘酚钠，
- x/ r  A* Z8 t' A  r
* ~  m( ~% v0 S产生α-萘酚。后者与重氮剂偶联形成红色沉淀物，沉淀物的显色深浅与NAP活性成正比。8 q! k* J, A' M( Z8 \2 ]5 q& b% q
! `6 Y8 z0 ]1 h7 B+ {1 F9 |- k
正常血细胞反应 :1 _: j( {; s+ ?& r- [' ?

& X( \. w5 w/ }2 d1 w中性粒细胞碱性磷酸酶是中性粒细胞中的特异性颗粒 ("S" 颗粒 )所释放的一种酶, 存在于细胞质内的三级颗粒中呈不规则形的管状结构, 该酶的活力与积分受到体内许多因素的影响。如中性粒细胞的成熟程度、HbF、内分泌功能等均能使NAP的积分产生一定的差异,但正常人群中性粒细胞的阳性程度一般很少达到3分, 绝对达不到4分。其酶活力的正常范围通常为：
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7 r( i8 A: A# }3 F0 C细胞阳性率 ；2～56个/100个成熟中性粒细胞；8 K9 n, a- Q! H. _" O- h
- T7 o* k; K- {6 Y" A; o
阳性细胞积分：4～80个/100个中性粒细胞3 ?3 J# ]+ S; x( Y  \! y$ b1 u
) V! A" e" D# _$ s4 n& i$ V
病理变化：
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NAP 积分增高：
" i+ s  S5 J! v3 f* c5 L2 ?7 k+ h2 x: \0 `8 v
1. 细菌感染,凡革兰阳性球菌感染、NAP活力显著升高。
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2. 真性红细胞增多症,NAP活力持续增加,且治疗后未见能恢复正常。# Z- j* J# z+ a3 [, `

! W9 e0 p7 r( z" `/ h" ^' `/ ~& G3. 再生障碍性贫血,NAP活力持续增加,经治疗缓解时可有下降趋势。
5 Q% c! E7 u/ j- }3 j! J& {4 W7 A+ ~3 I5 W- v3 s2 `
4. 类白血病,由化浓性球菌引起的类白反应,NAP活力明显升高。
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5. 急性淋巴细胞性白血病可见NAP中度增加,而多发性骨髓瘤则活力显著提高。& C* `6 V0 G1 P  k6 f
. r" S4 {5 n6 h+ t
6. 其它类型如烧伤、中毒、手术后、外伤等均可使NAP活力升高。/ H- g( H0 ^4 G1 h6 a+ h

7 g6 u2 S5 d. |: LNAP 积分降低：+ I- \0 L' H0 r9 ]5 n
$ h! p  E  ^( a, P: w/ w2 D
1. 粒细胞缺乏症、脾亢等疾病时NAP活力下降。; _# Y8 M1 G9 F; R- }7 ?1 ?: G

  M  f* H! }7 _, m& {+ o2. 感染, 由革兰阴性杆菌、结核、病毒、立克次体病等NAP活力可明显或重度减低。8 e  X$ u: I1 g9 [* ]
7 O/ c" M% l9 h% O& O. ?
3. 白血病,单核细胞和粒细胞系统白血病,特别是慢性粒细胞白血病 NAP活力
) S8 F% G% L, q) Q7 H9 E# ?/ G, _8 _0 y
明显减低甚至消失。
0 @1 N* s1 A# q* A' e  Z" E
6 K9 q  a- k9 H- P6 a% |' `* k临床评价:
# R# r* ]9 h2 C' l7 {  y% k# d4 u7 H  P1 x) f  n* t
    若配合染色体检查及分子生物学诊断技术可提高慢性粒细胞白血病的诊断；配合酸溶血试验,尿含铁血黄素试验可提高PNH的诊断及有利于PNH与再生障碍性贫血的鉴别；配合其它细胞化学染色可辅助鉴别急性淋巴细胞性白血病与急性非淋巴细胞性白血病。
, Z2 j' S# r& c* h8 H4 j1 b
+ T& _3 [! N  r操作步骤：  T# j9 G& c( Y" G

2 q, Q+ N" |) z# ~% s( Y    将新鲜涂片滴加固定液（4℃）30秒，水洗待干备用。将NAPⅠ液置入NAPⅡ液混合成为基质液(可先吸取少量NAPⅡ液置入NAPⅠ液内，待NAPⅠ液充分溶解后再一起置入NAPⅡ液内)。将涂片置入后，37℃放置30分钟。连染色缸流水冲洗数分钟，取出待干。苏木素复染1～2分钟，水洗，待干，镜检。1 W/ H6 A" z" t: E4 V
- o* o8 Y+ h: t4 U  Z9 S5 O
结果显示：& E* E* A5 W6 B! F$ ^: v

3 c: S4 a% o" H4 M阴性 —（﹣）0分：胞质内无色。
$ G* p5 a" e: e- t$ R" _7 ^( A4 f, t
阳性 —（+）1分：胞质见浅红色，无颗粒或有少量细小颗粒但小于胞质1/4面积。
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7 l4 b6 X; ~! I0 d& r（++）2分：胞质见红色，有较粗红色颗粒但小于胞质1/2面积。
6 V. f( i& Z1 w: a, r; Q) U7 v. V" f* Y; h# h( |, {& _
（+++） 3分：胞质见粗大红色颗粒，可达胞质面积3/4以上。5 r0 @! f( e/ l, ]( X$ c: U
) D5 `0 A" F: f. F- x: {
（++++）4分：胞质见粗大深红色颗粒，达胞质全部面积甚至可掩盖于胞核上。
  K- h6 n; A9 X  _1 D& v" x4 d4 R. M$ |5 I6 M6 W7 X
注意事项:+ F  L2 @9 a) k: `$ g$ l; c! B
3 q- }$ t- m6 m  s
1. 年龄变化：新生儿NAP活性较高,以后逐渐下降。/ T/ ^' G3 k6 b* A

( l7 @7 ?4 U5 ~- o5 }' i2. 应激状态：紧张、恐惧、激烈运动等NAP积分可增高。
& k, c+ f+ a+ r, B$ H: G7 B8 M
5 y9 Q! {% q- c6 k! F, W  F3. 妊娠和月经周期的变化也可使NAP的活力有所差异。
# i1 k" Y  C7 @7 s  l( b( F: [7 C
' P7 U3 q( x* Y3 \7 j; R; Z4.药物所致,特别是激素类如肾上腺皮质激素、雌激素等均可使NAP积分增高。: E6 I. ?. Y- m( @  L8 w
7 e5 k4 [2 U4 Y4 o2 t( w: u
5. 每次实验均设阴、阳性标本对照。# s, v% \) D- R: Z1 o# Z; i
& ~; j- P# i( q- A% _* e3 q
6. 实验室操作人员最好相对稳定，尽量减少室内误差。( y8 X; B7 o( i$ `

$ T  g' X. w6 @, e* w% \7 _7. 观察结果时需注意涂片的部位, 最好选择体尾交接处,有时不同部位其阳
- y4 i& k( R3 p2 F1 }5 k
" p* ~; L4 ~% R性强度可相差二个(+)以上。尤其作慢粒随访病人积分计算时需特别注意。
7 x1 \& A: Y( L3 j/ Y9 _& ^  ^- h" [; u3 D; n7 A5 y7 C9 I; d# H
常见问题与结局方法：
! y% q* i% A4 G; n9 q3 W* o7 u4 Y$ w2 x% o8 ~. [% f" ?
常见问题4 ?( @3 m3 j# l1 p
原因
, e* ~+ d! q4 U0 l3 w2 a$ D, m6 O解决方法" i! i; k- {, k) c
未见阳性或阳性减弱：
0 a" |% _8 S$ \; P# t& f试剂盒过期太久         从新购买试剂盒- g7 o; t/ V7 \* {7 Y- x/ g  x* K
载玻片未洗净标本被污染         取干净玻片从新采集标本& \$ H# k6 T& e  A! E; E: [7 U6 K
标本放置时间过久且未固定       
& N- Y% p4 t8 V+ i* L从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕
- o+ W* f4 S. [( Z7 X3 ~
$ s# \8 K3 x3 D8 Q固定液使用时大于4℃         另取标本重新用4℃固定液固定
1 O7 L# ?4 @& h9 Z采用了加有抗凝剂的标本         从新采集标本/ l# T1 y+ P) p) j9 U) @$ O2 W
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等         采用未被污染的标本重新染色7 E6 m( n2 x3 J' `' o
试剂配制时Ⅰ液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解         需取新试剂从新配制
/ F& _( B1 W0 R试剂配制后未及时使用         需取新试剂从新配制
9 e5 m) b+ ~6 U# Q" k: r8 f# U孵育时间或温度不够         调整温度或孵育时间
; z  d6 V1 x/ x  X, ^* r% x: @. {: @; D& M
染色背景太复杂：3 v8 e: u; ^3 q: F0 a* b3 y+ N9 D! M
背景细胞染色过深        孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色
8 a8 K5 f0 y# o- ^  i染色后冲洗方法不当       
) O! I' k1 C* l7 Y, [不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟6 X0 c* K) Q$ D4 Z, _* o
; x. @6 _/ @% k! B" ?
复染后水洗时间不够        复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

zuming

细胞内酸性磷酸酶染色) ]3 d+ }1 M3 L/ i
acid phosphatase in cells ,(ACP)1 S7 S7 y! Q, M8 x5 g) I* y

# L) J5 f, m) w3 u原理:  j  b( n) ]5 C' ?: X

! m( Z0 O6 G1 K( E; V3 U9 X0 v! `    酸性磷酸酶广泛存在于人体组织细胞内, 其最适pH为4.5～5.5左右 , 酸性磷酸酶通常存在于溶酶体内, 其同工酶有七种。血细胞内的酸性磷酸酶（ACP）能水解磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与偶氮剂偶联形成红色沉淀物。沉淀物的显色深浅与ACP活性成正比。
+ O- i( _) G% ]* J0 m* p
9 x4 X& t6 B7 b' Y( H1 n& W正常血细胞反应 :
, K& J2 r7 H) \: e8 O, t; e) h  D7 B: J! I4 N
粒细胞系-----部分成熟粒细胞可呈弥散状弱阳性, 定位于胞质内。
# H4 n5 x/ Z" G淋巴细胞系-- ①部分T-淋巴细胞可呈粗颗粒或小块状阳性,定位于胞质内。
( _0 u- r; T  B②部分B-淋巴细胞可呈细颗粒或弥散状阳性,定位于胞质内。  v4 d5 Z3 X! ?- |9 @
- Z. z* f% |4 p8 A( }1 e
单核细胞系---部分单核细胞可呈弥散状弱阳性,定位于胞质内。
6 y! n- A0 ~$ Z- s& u巨核细胞系---巨核细胞和血小板可呈弥散状弱阳性, 定位于胞质内。2 s7 C- A# o! S$ u3 M" x
网状细胞、吞噬细胞、组织噬碱性细胞可呈弥散和/或颗粒状阳性,定位于胞质内。' ~' ?' [( }% @! B
红细胞系----基本呈阴性." a2 l* f& D2 s
病理变化:
- Q& i( h; I) e  ?9 Y9 a8 \* z. |8 V6 r6 o
    酸性磷酸酶在T-淋巴细胞异常增多时都具较强的活性, 特别在急性T-淋巴细胞白血病时最为显著, 但对L(+) 酒石酸敏感受其抑制, 在B- 淋巴细胞异常增生时, 多数为阴性或弱阳性反应。而多毛细胞性白血病可呈较强的阳性反应, 且因含独特的同工酶5,不被 L(+) 酒石酸所抑制。所以酸性磷酸酶对多毛细胞白血病的诊断具重要价值。$ U& F; i( _" h! |. x

4 M! H: F3 f. W3 t在急性非淋巴细胞白血病中, 单核细胞系统反应比粒系细胞系统较强。多发性骨髓瘤细胞、浆细胞均可呈强阳性反应。另对高-雪细胞和尼曼-匹克细胞的鉴别有较重要价，通常高-雪细胞呈强阳性反应而尼曼-匹克细胞呈阴性反气应。. d0 e. j5 ~: m7 v8 Z2 ^+ W' A1 v

! l4 R5 q* a9 h# Z, U& ]临床评价 :7 u- G8 ~0 F+ R# l6 N8 B% O
, f7 f* v# P2 A8 U9 _
1. 结合电镜超微结构检查, 可对多毛细胞性白血病作出诊断。& a: e) \+ \# l

8 M5 h1 \: G1 {$ z6 w2. 结合细胞免疫表型检测, 有助于区别各种B-细胞克隆增生性疾病 , 如慢淋与毛白、B-ALL与毛白。
* D2 z5 I) s0 T( G5 @* d  G, M0 i1 u% G9 t3 d& [0 {" X, `0 v. P* O" s
3. 结合其它细胞化学染色,有助于对急性粒-单细胞白血病亚型的分类。
6 @4 t4 [  @9 n& H( i9 x' g  u* O# `& q1 X
操作步骤:
# d, L- r+ i, B7 i, B
: \. ]  C4 L3 D    将新鲜涂片滴加固定液5～8滴 ，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗备用。将ACPⅠ液、Ⅱ液加入ACPⅢ液中混匀(可先吸取少量ACPⅢ液分别置入ACPⅠ、Ⅱ液内，待ACPⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入ACPⅢ液内)成为基质液。再将涂片置入后，37℃放置90分钟，流水冲洗数分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检。
$ i. x4 i# m1 i# i. r- |' w
3 X0 q& L4 c" H2 `, _& f1 T7 P结果显示：
7 o6 c9 O' i2 P+ J
& o$ c, \- q8 u7 x5 @阴性 —（–）胞质无沉淀物（无色）
# a1 s- f* `& e( l& N4 }1 l, m0 R) F. u: S# ^8 Q
阳性 —（+）胞质见浅红色或有少量细小颗粒。
% _- V2 u3 N- f6 p" ~- ^# @" n0 V) ~
（++）胞质见红色或有较粗红色颗粒但小于胞质1/2面积。% s3 ^2 s% ?: e7 G' I

2 }& f' o% @1 U（+++）胞质见粗大红色颗粒，可达胞质面积3/4以上。
$ Q$ R. U8 n, M+ {
' f( a1 q: Z; f% J. ]- X（++++） 胞质见粗大深红色颗粒，达胞质全部面积。
  U9 W( b) G4 S% Q' J4 E: ]7 P# D7 E2 @+ L. |- Q/ Q
注意事项:0 i0 ^9 e0 w# u* z. \3 g

7 X1 q0 C* j2 j( L+ C+ |1. 由于含酸性磷酸酶的血液细胞有许多, 且各种细胞所含ACP同工酶不同, 即同一基质可有阳性程度的差异, 在同一类细胞中可因基质不同而使阳性结果存在明显差异, 特别在不同的实验室之间龙为突出。
" V9 p6 s5 ?) h
/ X7 A7 g% e2 o! w( P2. 在每次操作时均应设正常标本阴、阳性对照。
& U1 f7 X8 ]4 p7 C- J+ H" @9 c) z; l) s* `" }/ P
3. ACP染色结果以弥散状阳性出现的细胞较多,如为弱阳性反应, 在复染时应注意在涂片纵向复染一半, 另一半不复染以利弱阳性的观察。
+ O2 |; Q' p, e3 _$ I! }: [+ k; K5 u5 C
4. 实验室操作人员最好相对稳定，尽量减少室内误差。
$ w* Y4 b$ F  y. q: `8 L8 q3 P2 H8 N) ~; @; J  {& x2 O1 C" M
5. 观察结果时需注意涂片的部位,最好选择体尾交接处,有时不同部位其阳性强度可相差二个(+)以上。作L-酒石酸抑制实验时需特别注意。
- a5 P- W: q6 A! _
$ ?% f2 v$ E5 m常见问题与解决方法：8 M- y! y! Y6 M" _' O6 S9 j! F
) @- O  X6 J) _! G
常见问题0 a8 H) g* [4 ?, ]" T, i8 h; r
原因* n9 _0 f6 |2 N' K+ I. _6 c
解决方法
3 N" ^0 a1 S0 S+ |未见阳性或阳性减弱：5 r) o( h7 m+ @
试剂盒过期太久         从新购买试剂盒+ u( T7 t( W, {% }0 `
载玻片未洗净标本被污染         取干净玻片从新采集标本
6 d  }- K3 e$ N  ^标本放置时间过久且未固定       
9 W4 a+ K1 m4 Y( @; k9 V从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕" \7 t; M8 C0 X) ^  A9 I2 z. Y

- V) \. P8 {0 p# f/ L0 {固定液使用时大于4℃         另取标本重新用4℃固定液固定& A; d' _8 W- s, T! l
采用了加有抗凝剂的标本         从新采集标本* T3 d* Y8 Q8 l
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等         采用未被污染的标本重新染色
) S' }) d$ }. u, v试剂配制时Ⅰ 、Ⅱ 液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解         需取新试剂从新配制8 j. X0 b0 K; B4 A
试剂配制后未及时使用         需取新试剂从新配制6 f2 h" U, z: ?8 m7 P' x4 \
孵育时间或温度不够         调整温度或孵育时间
) n3 P* _! A0 _% ?! I1 j0 d
5 Q2 o5 f% q" s5 P8 P染色背景太复杂：
: o, M# w' U6 R# s背景细胞染色过深        孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色* _3 ]1 e* g# m: x
染色后冲洗方法不当        , q- A: Y* L: t, Z4 b
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟
) W, h2 L) K- s0 w% Z, W" M复染后水洗时间不够        复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

zuming

氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色: d- K' P/ \/ Y' m' Q& U. D
naphthol-AS-D,chloracetate esterase(AS-DNCE)! X1 E: D2 T6 L7 s
' I( S: |. [  E1 p$ b+ r4 [) t
原理:" Z  x2 M$ U7 @. f/ v
2 ?- j. ^2 d4 k% b& o
    一般认为, 氯化醋酸萘酚酯酶是粒细胞及肥大细胞的标志酶, 其主要存在于粒细胞(包括分化较好的原粒细胞)的溶酶体上, 此酶与过氧化物酶在中性粒细胞中均呈阳性反应，但此酶形成的产物比 POX 更为特异。血细胞内的氯化醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)将氯化醋酸AS-D萘酚水解 ,产生萘酚AS-D，后者与重氮剂偶联形成红色沉淀物。沉淀物的显色深浅与AS-DNCE活性成正比。& r$ J; C3 d+ W# w1 d4 s# c

! P: P  y$ p5 `正常细胞反应 :: ?6 D, J) G9 G: b# h
2 U4 E- o' A* ^7 s1 `: w
粒细胞系---中性粒细胞(除原粒细胞外)均可呈阳性或强阳性,且酶活性并不随细胞成熟而增强，定位于胞浆内。嗜酸和嗜碱粒细胞为阴性和弱阳性，定位于胞质内。% [1 i6 k8 j2 G7 e
2. 肥大细胞有时可呈阳性反应，定位于胞质内。
$ j4 }3 c6 ~; i* J* @$ d! {' H
7 V9 F/ ^0 A3 W, ]3. 红细胞系、淋巴细胞系、单核细胞系、巨核细胞系、浆细胞系均呈阴性。
% l/ s! J3 s8 `5 |& W) Z) y! Q6 T' U1 L; S! ^, ]! @5 `% ^
临床评价:
9 N1 {% i+ l/ v+ `2 a) k) S# j$ n9 V  @; w7 B1 d2 \' m
1. 氯化醋酸萘酚酯酶亦称为粒系细胞特异性酯酶, 如与细胞免疫表型检测相结合, 对AML分型具有很大的价值,特别是结合CD13、CD33、MPO 等单克隆检测结果, 对AML-M0的诊断有极大的帮助。
1 y! c  n! g  i" v, h" M. N% E+ d) p+ _. D3 L
2. 如将氯化醋酸萘酚酯酶染色与α-丁酸萘酚酯酶染色在同一标本进行双脂染色、其对AML- M4亚型分析非常有价值。因氯化醋酸萘酚酯酶仅为粒细胞阳性, 而α-丁酸萘酚酯酶可视作单核-巨噬细胞系统的标志酶。
. C0 Z2 }8 i# d* h5 Z1 V0 N; W1 Y. G: ]1 q- a" m: g* r( B
操作步骤：
  R( P8 G8 ?. ~$ F$ b
- w5 _( D% A( N, C; L    将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将AS-DNCEⅠ液和Ⅱ液置入AS-DNCEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量AS-DNCEⅢ液分别置入AS-DNCEⅠ、Ⅱ液内，待AS-DNCEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入AS-DNCEⅢ液内)成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检。
2 U. Q8 t# i0 [* ~8 @
' a: b' [, T" b! ?  o* J3 W+ H结果显示：1 _& }; Y& X0 B5 m& m
; H9 A5 e3 _) G3 D9 A6 E# j# ^7 L7 d
阴性 —（–）胞质无沉淀物（无色）: F$ r2 Z1 S! Z% b, g! m* _. E& H$ A) ?1 D
5 L% d9 c0 v$ {+ A- l, E  @( n
阳性 —（+）胞质见淡红色，无颗粒或有少量细小颗粒。
0 A* s6 y* i; q) J+ n, Q/ \' u
: y- W9 n; W, ?* d/ ^（++）胞质见鲜红色，有较粗红色颗粒但小于胞质1/2面积。
8 x2 o- s4 X3 ?0 x+ Q2 ~, W+ X- H% i
（+++） 胞质见粗大深红色颗粒，可达胞质面积3/4以上。
' L* |" }, D  ~  u5 Q
5 D" x5 c/ {* u; ]（++++）胞质见粗大红紫色颗粒，达胞质全部面积甚至可掩盖于胞核上。
. q* Q: O5 o$ }* J) }$ v, U
( H3 m- s2 f' r0 k! Y4 C ' C" `. c; F8 I2 K

1 ~% A. [$ v5 [注意事项:
2 [& {  [4 a  ^, Q5 I: I  V' u& o' {5 l% U0 K4 H
1.此酶主要以定性为主，而阳性强度仅作为参考。因为酶的活力并不随细胞成熟而增加。! L- M/ i- {* ?  a/ z

7 m* P' b4 s  _2.标本必须新鲜, 取材后如无法及时染色可先行固定。
0 |, |- Z5 b8 `  n8 l" [- z+ r: F. u2 {' {  n
3.每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。& H! [) H9 ?% `7 s( e3 V

! J6 A. e- X  T( p3 ]9 W4. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。4 k  L. y- f  m* W! ?8 N# H0 \

% ^3 i7 u8 z6 `! ?# C' F; a5. 氯化醋酸萘酚酯酶染色与α-丁酸萘酚酯酶染色在同一标本进行双脂染色
5 Q# z  p6 P; x( Z3 u) q$ z$ T/ ]- |
须向公司另购双酯酶染色专用试剂,用常规染色试剂无法分别阳性结果。* B0 F/ `4 y# G
( Q& ~) s& ~, u
常见问题与解决方法：- i* S' f) R) [3 r

( _: w6 g1 A% l6 f. m1 D4 `5 Y常见问题
6 k* o. i+ S! Q1 l+ S原因# Z/ V( A) H" m& M  K
解决方法
: u0 i  n4 i) Z# F& i+ M% K+ c未见阳性或阳性减弱：
5 ^" ]  Q+ d9 |4 n) P2 h试剂盒过期太久         从新购买试剂盒
( Y% Z9 `  _' w. o; H; g载玻片未洗净标本被污染         取干净玻片从新采集标本8 y" k2 @0 u5 z* f" L6 b/ L
标本放置时间过久且未固定       
6 ~/ D  D2 E5 F: X5 [从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕
. `, G7 z# f' H" K6 s+ r& B
. B  h3 A' Z9 I, X  u8 c固定液使用时大于4℃         另取标本重新用4℃固定液固定
. A' }0 n6 f- S3 V采用了加有抗凝剂的标本         从新采集标本) l% o. l/ `& V% ?  \+ d: o* }& ~( l
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等         采用未被污染的标本重新染色: n7 R; K6 b, n0 n- I
试剂配制时Ⅰ 、Ⅱ 液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解         需取新试剂从新配制
, x. O7 P7 z1 }& m8 ]试剂配制后未及时使用         需取新试剂从新配制' M5 N; y1 K6 V! t& U2 c0 o
孵育时间或温度不够         调整温度或孵育时间
! ~7 q7 u) R0 Q# p. W+ |
, C- h) t( f4 D5 D& B( U7 c染色背景太复杂：
  p9 g9 I, @" x! [% j" P背景细胞染色过深        孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色6 [3 d9 C1 V% A) l
染色后冲洗方法不当        ; J, M5 \# H& N6 F+ ?% R* c
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟1 i  F- ^  P* |- [7 Z* b- C( _; c
复染后水洗时间不够        复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

zuming

α-醋酸荼酚酯酶染色. h8 I6 R0 s3 f" [0 N$ _
(α-naphthol acetate esterase,α-NAE)、
  u3 N3 `8 L* d, Y; V9 ?4 a- B
0 N; H6 e$ ?# M. s) P+ k原理：4 [0 o! Z  ~$ c6 x& |- T, E

* a" _4 l# `( E) D* F    血细胞内的α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）将基质液中的α-醋酸萘酚酯水解，释放出α-萘酚，后者与重氮盐偶联形成灰黑色沉淀物。沉淀物的显色深浅与α- NAE活性成正比。
' \! N  c# S  x, X4 h$ r6 K: A3 d% A
正常细胞阳性反应:
0 m7 O2 B8 `6 G4 G+ h" d7 ~' X2 \/ E2 _
1.粒细胞系----少数中晚幼粒可呈弥散状弱阳性, 定位于胞质内。
& F. z* g6 i  r5 }* K9 A
. I4 o+ y) a8 S1 i- t, Z2.单核细胞系--成熟单核和幼稚单核及部分原始单核(分化较好)可呈不同程度阳性, 定位于胞质内。7 t- c7 R; A. M5 }" |

6 s3 ~0 I9 f9 b; v! a5 y3.红细胞系-----部分中晚幼红可呈弱阳性，定位于胞质内。3 V; ~, J7 Y  I; v3 Z
: I( E- ?) }' @
4.巨核细胞系--巨核细胞和血小板可呈弱阳性或阳性，定位于胞质内。
2 ~. G% c) o, X- ~& I. H
2 L$ S! @; Y9 k5 U, N0 P# D0 [6 C5.淋巴细胞系—部分淋巴细胞和浆细胞可呈弱阳性，定位于胞质内。
- I5 \9 B' b8 z/ [0 l
/ H6 q, J8 t9 e1 t6.吞噬细胞----可呈强阳性, 定位于胞质内。5 Q  j. r3 L, F& l

4 M7 j( ~6 L9 S0 L临床评价：
& B; L3 v8 I4 g/ _: Z" i; ?/ c/ C1 J8 ?# j7 k- ^' t8 Q
1.α-醋酸荼酚酯酶染色属临床上常用的非特异性醋酶染色之一。此酶在单核细胞、吞噬细胞中含量较多且多数受到氟化纳(NaF)抑制；粒细胞、淋巴细胞、部分幼红细胞、巨核细胞和血小板等含量较少。非特异性酯酶由于具有较多的同工酶，且不同种类的细胞内存有的同工酶也不尽相同，所以此类酶除了在单核-巨噬系统反应较强烈以外，其它细胞系统也可呈现出不同程度的阳性，所以对细胞中非特异性酶酶如能组合检测比单一检测更具价值和意义。非特异性酯酶染色的主要意义在于结合细胞形态，结合其他细胞化学染色，为临床急性非淋巴细胞性白血病的分型和亚型确定提供重要的依据。9 P+ J" i  R! O' }8 n* I4 m+ n/ j
8 j6 J" q' j$ e/ a
2. α-醋酸荼酚酯酶因主要存在于单核细胞中，且为同工酶4、5，而中性粒细胞含有的同工酶为1、2、7、9，由于一定浓度的氟化钠能完全抑制酯酶3、5、6，此特点在对急性髓性白血病中M2、M4、M5等分型和亚型分类有一定参考价值。另由于巨核细胞此酶也可呈阳性反应, 如结合酸性磷酸酶染色(ACP)和免疫表型检测, 可对AML-M7作出诊断。
' U4 g! n. `& S7 L9 w' m7 I: e  `  n- t# F5 J; S
3. 非特异性醋酶染色若结合POX染色和PAS染色(双酶染色)来综合判断结果，特别是如能将POX 染色与α-醋酸荼酚酯酶染色联合显示于一张标本片上，这比分别染色效果要更好，对M4的分型尤为突出。
7 |+ K' @# J; n% _" `( T
0 x! h5 H' g' P$ O8 k& }! F4. 将AS-DNCE染色与α-醋酸荼酚酯酶染色同显示于一张标本片上，即双醋染色，可使单核细胞和粒细胞系分辨的更为清楚, 并且能发现在同一个细胞上同时存在二种酯酶呈阳性反应, 称酯酶双表现型细胞，为M4的诊断与分型提供了有力依据。
/ E$ B$ J$ a9 P' n; x; b7 \8 z0 g! E6 C1 g; W$ \  G
操作步骤：# E- {7 ?0 A6 c
8 E, n$ V" h* _* ]
    将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将α-NAEⅠ液和Ⅱ液置入α-NAEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量α-NAEⅢ液分别置入α-NAEⅠ、Ⅱ液内，待α-NAEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入α-NAEⅢ液内)成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检。0 J9 t4 Z1 E9 q4 O
' Y8 z8 g+ u2 T2 Z+ I+ U$ h
·NaF抑制试验:
# o. X6 V; V' h! `$ A% ~) s8 a5 K6 ^! @: U& v2 a
    将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将α-NAEⅠ液和Ⅱ液置入α-NAEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量α-NAEⅢ液分别置入α-NAEⅠ、Ⅱ液内，待α-NAEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入α-NAEⅢ液内)，再加入NaF一瓶（订货时可向公司要求配置）成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检/ r) h8 Z- B* a2 H" |7 Q7 M

0 {3 Y4 ]0 m9 @  L+ f1 T" H2 U; m结果显示：* n' Z, t/ j5 F/ m
9 X5 b% t. o  H6 y! E
阴性 —（﹣）胞质无沉淀物（无色）) Q( y, |( a. n! N1 E: M
. C  m4 B; c0 Y% Y- l4 E; Q" f+ G
阳性 —（+）胞质见浅灰色，无颗粒或有少量细小颗粒。6 M9 u) O1 ?2 v" D6 [: d

8 C, H* O5 i5 |) J. \; L2 A（++）胞质见深灰色，有较粗灰黑色颗粒但小于胞质1/2面积。
% N/ F4 Q1 p$ }; K* M2 w: k7 o1 s5 R5 U/ F; \; c7 N
（+++）胞质见粗大黑色颗粒，可达胞质面积3/4以上。
' f0 l  H9 h: \# p. _9 R% D0 y( b6 H: e0 b0 \3 ]' O* O
（++++） 胞质见粗大深黑色颗粒，达胞质全部面积甚至可掩盖于胞核上。
3 l3 \- K6 B1 i/ @. ~6 S# [0 A& w  g( p3 `, m# Y1 ^
注意事项：3 ]  I% F* E" p2 F) n& G' r
$ u% k, O' h9 g+ a' Q* `4 x
1. 酶的活性随标本采集后的时间而逐步下降，如无法及时染色，应先固定否则将影响阳性结果。$ I) U2 A: ]& E

' M8 |7 u# J! p8 g2. 涂片固定时滴加固定液要迅速一次盖满血膜，反复滴加可造成染色背景深浅不一。影响结果观察。- L3 Y. n8 n4 C+ j7 C
1 A* l2 w2 F9 C) k, s* `' Y
3. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。  Z0 w$ y# q; `6 J" R+ K

  ]- t9 Q  z/ Z* y3 [2 e以防引起背景污染，冲洗困难，特别在冬天，易使涂片表面产生脂质沉淀从而影响结果观察。) w$ R0 W! F3 I) K1 L
5. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。
" x7 ^1 r1 `: ?& B& O2 X
+ y) O2 H* w' C. @, j( m' h6. 观察结果时需注意涂片的部位,有时不同部位其阳性强度可相差二个(+)以9 D9 m2 S0 D7 f7 q9 @2 f

/ V" E. W4 `# q9 c7 Y+ J上。作NaF抑制率计算时需特别注意
% O! ~# {5 E9 J( [2 O# [( H
: M6 X; O1 T3 L常见问题与解决方法：
) L  P+ r4 X6 m  C! q( V7 j4 e9 w8 h
常见问题- i9 Y: }9 @# S- ]3 d
原因6 {$ F2 B8 x* D2 i* [. W2 {6 @, @$ v5 U9 y
解决方法  l. V: {- ]% D# ]
未见阳性或阳性减弱：5 e: R: [5 ?+ \7 l$ @5 B
试剂盒过期太久         从新购买试剂盒
9 `: W3 A- P+ h: r1 t载玻片未洗净标本被污染         取干净玻片从新采集标本6 G' G. H; O+ B
标本放置时间过久且未固定        4 ]8 ~4 T% ]8 [# F' d$ S
从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕. i, n4 @. T8 k

2 G. y7 }9 e( J- k5 X, [' \固定液使用时大于4℃         另取标本重新用4℃固定液固定
5 U9 U& t4 d. X4 m采用了加有抗凝剂的标本         从新采集标本
5 d% W4 _! |8 {7 z7 j2 T9 v标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等         采用未被污染的标本重新染色% I, _3 p; }; U# A4 }
试剂配制时Ⅰ 、Ⅱ 液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解         需取新试剂从新配制
( f/ f6 ^- }" k试剂配制后未及时使用         需取新试剂从新配制
9 ]! F! |7 H- L. s% u孵育时间或温度不够         调整温度或孵育时间
, d) X, X* }. r+ a" U" L: c, _7 {6 Q% \. m) l# ^( t9 t; N
染色背景太复杂：
9 f6 \) a/ K  l9 I% M  }& b8 C, g背景细胞染色过深        孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色& K/ X+ s' e, j4 S( K* v
染色后冲洗方法不当          a  K/ j6 C% ^; x2 f, S5 j7 [
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟$ s1 e' l0 _4 d% h/ v
复染后水洗时间不够        复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

zuming

α-丁酸萘酚酯酶染色
, t( M6 S8 c6 x, H% F. V+ G(α-naphthol butyrase esteraseα-NBE)
' O( I0 H7 M) Q0 S
8 f8 _/ F, R6 \# L原理:* X" x1 [: q4 p& |: S$ i, d

; M/ q6 m, t: L3 v    血细胞内的α-丁酸萘酚酯酶（α-NBE）将基质液中的α-丁酸萘酚酯水解，释放出α-萘酚，后者与重氮盐偶联形成棕褐色沉淀物。沉淀物的显色深浅与α-NBE活性成正比。. R. ~( q, z8 z% z

% U+ G! q( a/ u! k0 ]2 t正常细胞阳性反应:
+ ^! o$ o5 o% Y7 p6 c# @
; H  L- |# f* l4 |/ \+ @1 Z+ [1.粒细胞系----个别成熟中性粒细胞可呈弥散状弱阳性, 定位于胞质内。) @8 y' y$ s) P/ W

2 |( r' f' T* ^2 e2 N, z( A( t7 j0 [2.单核细胞系--成熟单核和幼稚单核及部分原始单核(分化较好)可呈不同程度阳性或强阳性, 定位于胞质内。
( V2 `% Q6 f5 S/ v0 P. [! v1 B0 _' [, a- r# M3 D2 O# o) q2 h
3.吞噬细胞----可呈阳性或强阳性, 定位于胞质内
3 t8 O5 h& V) n: s% Y) s' a4 r* R. N
4.红细胞系、巨核细胞系、淋巴细胞系、浆细胞均呈阴性。/ M; d6 k; \  P# h7 f7 Q# D

: o* {6 b& t8 Y4 L临床评价：/ Z5 v5 C, O2 h  R0 ?8 e) m- h: o

$ ]' I& |$ ?! G' T. X  J( p1.α-丁酸荼酚酯酶染色属临床上常用的非特异性醋酶染色之一。此酶在单核-巨噬细胞系统中反应强烈，同时此反应也能被NaF所抑制,而粒细胞、淋巴细胞、部分幼红细胞、巨核细胞和血小板等含量很少。所以α-丁酸荼酚酯酶亦被视作单核-巨噬细胞系统所特有的标志酶。若结合细胞形态和其他细胞化学染色，为临床急性非淋巴细胞性白血病的分型和亚型确定提供重要的依据。
+ j/ l3 ~0 N' _! N5 \1 s
! q3 O* M) I2 z' k5 {( V7 D2. α-丁酸荼酚酯酶染色也可结合POX染色来综合判断结果，特别是如能将POX 染色与α-丁酸荼酚酯酶染色联合显示于一张标本片上，这比分别染色效果要更好，对M2、M4、M5的分型尤为突出。
/ W! S! J$ j7 a* F2 ^7 k" m
/ ?8 g1 F# T: x9 R9 L' t) `将AS-DNCE染色与α-丁酸荼酚酯酶染色同显示于一张标本片上，即双醋染
6 F( Y  a6 F8 [0 O+ y2 W' U  @色，可使单核细胞和粒细胞系分辨的更为清楚, 并且能发现在同一个细胞上同时存在二种酯酶呈阳性反应, 称酯酶双表现型细胞，为M4的诊断与分型提供了有力依据。/ k* B' U0 p- K0 o  A
% O; ^9 u7 m+ I" f- ~" c
操作步骤:+ r7 s1 @2 I( A1 B$ `0 Y
9 N6 {* ?# o3 R* o1 `+ d/ `( e2 y
    将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将α-NBEⅠ液和Ⅱ液置入α-NBEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量α-NBEⅢ液分别置入α-NBEⅠ、Ⅱ液内，待α-NBEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入α-NBEⅢ液内)成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检。; ]9 x# I* F0 u; a

# [" `5 q# U9 k, ^) W·NaF抑制试验:
$ n$ ^( F7 h1 L. U5 Z$ m0 k# e
/ ]6 _3 J# [, f% D# |6 ^- D$ M    将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将α-NBEⅠ液和Ⅱ液置入α-NBEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量α-NBEⅢ液分别置入α-NBEⅠ、Ⅱ液内，待α-NBEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入α-NBEⅢ液内)，再加入NaF一瓶（订货时可向公司要求配置）成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检! @( T8 I9 X- }5 y' H5 O
2 h) O  A3 M) w9 p" v* k' {. @: h
结果显示：
! d( h) K7 A: U; Y4 s1 v, ?7 o. i8 p/ [9 A
阴性 —（–）胞质无沉淀物（无色）, {1 I$ X* Q; b; B- [

9 `- J  `* m- O" j+ g, D. ]阳性 —（+）胞质见淡棕红色，无颗粒或有少量细小颗粒。
* R% f% e! q8 u: X6 N% a; J- B( E5 o
8 V2 R. G& Q# x, z（++）胞质见棕红色，有较粗棕红色颗粒但小于胞质1/2面积。; B+ H9 x* S2 f+ f, x

3 w% g0 c% _3 R- ?3 s/ T（+++）胞质见粗大棕红色颗粒，可达胞质面积3/4以上。0 Y8 g5 x- B* Z1 V" v; o1 L, W$ \7 @4 t
; X8 `" G3 F0 I" w) v
（++++） 胞质见粗大棕褐色颗粒，达胞质全部面积甚至可掩盖于胞核上。
2 M' P" ]  Y$ ]9 A- N4 h
; o# r# }# G# `  m9 A* Q8 c注意事项：
: K, n0 y2 q% w! k2 v. Y9 o) I" ~+ E9 L' j0 @7 q4 h& q
1. 酶的活性随标本采集后的时间而逐步下降，如无法及时染色，应先固定，否则将影响阳性结果。
4 |' O1 D7 a, e2 F/ W
& i; ]6 `! b* w# l$ G2. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。9 O7 S. ^2 N+ z4 x; L$ R
* J3 m' l2 A9 b& M' C: b
3. 此染色冲洗时间需适当延长，特别在冬天，易使涂片表面产生脂质沉淀,引起背景污染影响结果观察。
7 i! \& n* r. I+ Z6 g# f, M/ o' C: ?0 |8 J* Y/ c' G
4. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。4 G' T0 K; {( @/ S$ g* R6 `8 N

0 U& c1 v8 ]* ?5. 观察结果时需注意涂片的部位,最好选择体尾交接处,有时不同部位其阳性强度可相差二个(+)以上。作NaF抑制率计算时需特别注意。
1 Q$ `( _% m" y- E; \
$ b  Q) a( y* J# w8 c# y6 P常见问题与解决方法：
' f8 s" u: g% n+ i5 R% A
/ \6 G1 r1 p! Y; i! s( K; X, U% p常见问题% N2 G$ T# u: V! s1 x- m
原因
: i2 j' K6 e1 \& U! ~1 y解决方法
; p. _. F# s5 d+ e未见阳性或阳性减弱：
  w! A6 a( j  J- A+ o试剂盒过期太久         从新购买试剂盒  S% R# b! S% g, s- Z
载玻片未洗净标本被污染         取干净玻片从新采集标本
: C8 K  h% E; L' o* e1 s标本放置时间过久且未固定        # i) D+ e, l  N. Y/ @
从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕2 w2 [* U$ `# k2 Q2 s

( t4 s, p7 Y  c" W固定液使用时大于4℃         另取标本重新用4℃固定液固定8 X4 U% H3 q  U4 K! e. C+ |
采用了加有抗凝剂的标本         从新采集标本9 Q5 V. H  z/ ]# A2 I
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等         采用未被污染的标本重新染色. S9 ~. D0 P- x3 C4 y
试剂配制时Ⅰ 、Ⅱ 液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解         需取新试剂从新配制% k) s0 ~' j; M2 R7 U0 z! O
试剂配制后未及时使用         需取新试剂从新配制- T5 F+ p7 |& A6 a* O
孵育时间或温度不够         调整温度或孵育时间
( k; H: J; Q; {
2 \* x, v0 X+ \, H3 |染色背景太复杂：3 P& l" U6 p4 x9 U9 w
背景细胞染色过深        孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色8 f' r' G7 F* }# d
染色后冲洗方法不当       
  i2 J) }: I; i5 B不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟
$ Q* ], n# A+ b: Y. O复染后水洗时间不够        复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

zuming

过碘酸一雪夫反应
4 u6 F/ w+ K( b5 ]1 z) lperiodic acid Schiff reaction ,PAS; r1 H' }8 t, m) J6 U4 R

1 l  p4 {) O; Q* V4 A原理:
% Z6 T! |5 U" v- o& P' R9 E$ @
2 O/ P  X  `$ p" a' W    血细胞内含乙二醇的糖类物质（PAS）能被过碘酸氧化，形成双醛基类物质。后者与无色品红结合，形成紫红色沉淀物，沉淀物的显色深浅与乙二醇的含量成正比。
  b2 \6 u+ ~1 j5 V, m& ^; F3 m
0 `. f* l, ?" }1 _& v: E正常细胞反应 :: E5 z  \1 T) a  n8 V. R

5 g+ o: m$ c$ Z9 Q1. 粒细胞系-----原粒细胞多呈阴性, 通常随细胞不断成熟阳性反应由弱渐强, 至细胞完全成熟后达到最大强度。其中，中性粒细胞呈胞质内弥散状红色阳性，嗜酸粒细胞S颗粒之间的胞质呈红色阳性，嗜碱粒细胞呈大小不一的颗粒状紫红色阳性。
( z+ e/ Y' R7 s- J1 c) u: m! I1 F$ H1 |" p: U0 ]  Y
2. 单核细胞系---各阶段部分单核细胞可呈弥散伴细小颗粒状红色阳性。定位于胞质内。/ L" k: S1 e# V, E; ~
. _# |0 B& E( Y+ f3 Z0 s
3. 淋巴细胞系---由于亚群的关系, 可有所不同,T-细胞仅一小部分可呈粗颗粒和小快状阳性，但B-细胞绝大部分呈阳性反应。
) c8 q! T. k. `9 Y3 G; s
  ^$ F" v- A0 X2 G% {4. 红细胞系----红细胞系的各个阶段皆呈阴性反应，偶见少数幼红细胞有较弱的阳性反应。/ N9 z) K$ C) A0 b9 Y6 I+ Y
# y, w. L- Y" G) Z$ }1 m3 ?
5. 巨核细胞系-- 巨核细胞和血小板呈弥散性和粗大颗粒状强阳性反应，且随细胞成熟而增强。定位于胞质内。# I: m$ u2 k$ @! `
! I2 @, w$ `0 W: u: n  Y  d
6. 其他----浆细胞呈阴性反应, 偶见少数呈较弱阳性。巨噬细胞可呈阳性反应。均定位于胞质内。5 m1 p; F' u; ~2 O  `
/ }4 Q* m3 \9 s9 c1 Z
临床评价：1 l) k6 |/ \, [9 J
6 f9 ?* K5 A$ c2 e: x$ s, o9 z0 s5 _
1. 能被过碘酸一雪夫反应呈阳性的多糖类物质有糖原、粘多糖、糖蛋白、糖脂 , 还包括一些磷脂类物质等, 因此PAS阳性不能简单地就表明有糖原的存在, 只是在对血细胞的组织化学研究中通常习惯于将PAS阳性认同于糖原。
! Z. R+ l8 }; x5 v. C1 o
0 X- t: f& g0 x  i) I2.PAS染色虽然不完全代表糖原,但在血液系统疾病特别在各类型白血病中却有较大的应用价值。, f7 h3 t% B2 v, j

3 |* H8 R' e  }( @- T  A- ~3 o(1) 粒细胞系统: 糖原是保障中性粒细胞吞噬功能的能量来源,所以在急性炎症时PAS染色阳性程度明显增强, 在淋巴系统恶性增生性疾病、真性红细胞增多症、类白血病反应等时亦可增强, 在粒细胞系统恶性增生性疾病如急粒、慢粒等, 其阳性程度可减低。1 Y+ _! ?. m4 H% U6 k3 Y- j- J# H
4 g# x6 E( B- G3 |: z9 a; u
(2) 红细胞系统AS染色在红细胞疾病中具有较大的使用价值，在大部分红血病、红白血病及部分重型海洋贫血等疾病中可呈强阳性反应, 部分缺铁性贫血、重型海洋贫血、MDS、骨髓硬化症等可见阳性反应。其它类型的贫血如巨幼红细胞性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血等均为阴性反应。
* E5 i# {/ w+ f/ ?2 ^5 V( }: \
+ U/ t* f# |# l5 V6 g3 T: \(3) 巨核细胞和血小板系统: 巨核细胞胞浆中存有糖原和粘多糖两类物质，糖原呈粗大紫红色颗粒或块状，粘多糖呈弥散状红色细颗粒, 二者遍布于整个胞浆之中。此为一般血液细胞所不具有，利用此特点有助于与恶性细胞相鉴别, 并结合电镜PPO染色, 免疫表型检测以确定原始巨核细胞的存在和对M7的诊断。
2 u+ ~) A9 f/ I; ]' [" U: u7 S; S. q$ ~" d" t: `/ K
(4) 淋巴细胞系统: 淋巴细胞糖原的改变主要体现在不同类型的淋巴细胞克隆性增生疾病之, 其中尤以B-细胞恶性增多改变较为明显，如慢淋、淋巴肉瘤、急性B-细胞白血病等疾病的PAS阳性率和阳性强度可明显提高。而T-细胞恶性病变PAS强度无明显改变,另外，淋巴细胞由于感染引起的增多通常PAS多在正常范围之内。
+ s8 }% \+ M4 X( K. h
' F  b; d6 e1 i/ x5 |  v3.PAS 染色虽不能特异地表示何种病理改变，但结合其它细胞化学染色和细胞免疫表型检测及超微结构检查等,对部分疾病的诊断和鉴别诊断具一定价值, 如MDS、M6与其它类型贫血的鉴别；原淋细胞与原单核细胞、原粒细胞的鉴别 ;M6与M7的鉴别、高-雪细胞与尼曼达克细胞的鉴别、 (Reed-Sternberg) 瑞-斯细胞和巨核细胞的鉴别、骨髓转移性腺癌细胞与白血病细胞的鉴别。
8 r2 v( H9 q0 o( v' f
: X2 x2 T! F' Y, S+ K操作步骤:  w% n( Q9 p/ @) L+ G

! c* L$ n$ e8 d0 Q    涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，5分钟，水洗待干。滴加PASⅠ液10分钟(若实验室温度较低可适当延长5～10分钟)，水洗待干。置入PASⅡ液内室温（20～25℃左右为宜）暗处放置30分钟，然后小心取出涂片流水冲洗数分钟。苏木素复染l～2分钟，水洗待干，镜检。% q+ L0 V# k2 ]

" K- S) B8 N  c- r( x5 E结果显示：
# ^0 Q, A: b& Q6 E# V
; j- a7 i8 c& n3 a3 B$ D; c' n3 x阴性 —（–）胞质内无色。
5 T2 o/ o' b! B1 q0 @/ v% {
% q4 S* p* V. l2 ?+ C阳性 —（+）胞质内呈淡红色或有少量细小红色颗粒。$ Q) l& {; j$ S% p

% ?/ P2 _! e# j/ {+ B: W' t（++）胞质呈红色或有10个以上红色颗粒。4 g4 l8 K! ]( i. z. M
5 `$ Y( _9 ~6 p7 Z! K% H! e: K& X
（+++） 胞质呈暗红色或有粗大红色颗粒，可出现红色块状。: e1 Q7 z+ A4 f/ N
) b8 M/ c+ x7 G$ }! I2 y/ }
（++++） 胞质呈紫红色或有粗大红色块状。- w5 O! M' h1 |6 Q7 o
: F' m' w. V0 s7 ]+ v
注意事项:
+ N* k* ?4 j. G- z& I8 j5 ^6 c# L! }6 H( Y, [
1.标本除新鲜涂片外, 保存较好未被污染的涂片也可使用。( [: H: X1 e8 I6 J1 T

! [# d+ n) n& v& D9 e2.标本和器材应避免被还原基团的物质所污染, 以免出现假阳性。/ c% i3 V0 M! w( d
& b; w* R+ p6 Y! U: I
3. 涂片经PASⅠ液氧化水洗后, 必须待涂片彻底干燥后方可置入PASⅡ液中, 以免细胞间隙中的残留水份导致整张涂片呈鲜红色, 影响结果观察。
, d) y, k% U7 M& t2 m& h( X  x6 L' M: [
4. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。* L7 T% i# _2 P! i

2 V* a- t/ z" M1 w7 m8 d5 |7 `5 S5. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。
! N' Y3 ~+ _* _1 a* x5 V: ^, s4 m) H
6. 观察结果时需注意涂片的部位,最好选择体尾交接处,有时不同部位其阳性强度可相差二个(+)以上。
7 o% c* h! X2 O  J3 ]$ F
; T  `  h( k; p# S6 x7. 染色后应及时观察结果, 或用中性树胶封片, 以利长期保存。, d. Q! J1 z+ _  A

5 J9 W! t  f. z% t) k常见问题与解决方法：
2 e) j: o- a) _: {7 e. ~% X
6 q0 D. j( V) L: B: t% u1 a; c5 S常见问题
* z. m5 d6 r/ w原因
+ _; R6 q: b5 l, T* \9 G解决方法
1 {0 P: }4 @8 V/ f9 q未见阳性或阳性减弱：
7 D2 N7 {# {+ d试剂盒过期         从新购买试剂盒1 q8 _! m+ w# e. J% z
试剂开封后未盖紧        开启新试剂盒" M7 q; Q* @& _1 }$ J
PASⅡ开封后混入杂质或水造成试剂变质返红       
5 V' r9 [8 z7 s, [开启新试剂盒
. H& V6 j' f; N# c
# R1 t6 t  R  h9 x# b载玻片未洗净标本被污染         取干净玻片从新采集标本
7 G$ f; @. A: r# i9 ?采用了加有抗凝剂的标本        从新采集标本
0 r9 M1 k' {+ L! {2 g标本沾遇其他化学物质维生素C、 甲醛等        采用未被污染的标本重新染色9 Q: O7 c4 @) C) V) a( v
标本在Ⅰ液内氧化时间不够        另取标本和新试剂从新操作% T% d$ P8 `( p0 N# @; P* Q
试剂配制后未及时使用        需取新试剂从新配制9 }" r: s: d- X. I4 E
孵育时间或温度不够        调整温度或孵育时间  g) t! b  ~6 Z0 c, B8 R  n: I
" ^9 L2 B/ z) Y5 u' u- a0 x! o  O) n
染色背景太复杂：
" z- i5 x* X2 |' I( F0 `标本在Ⅰ液内氧化水洗后未彻底干透         若影响观察需另取标本重新染色9 b1 A( q9 ~* s
背景细胞染色过深       
" V$ w& N4 G  c5 K孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色: d/ y5 M0 @9 s0 c  v. C
染色后冲洗方法不当         不要连染色缸一起置流水冲
  q2 [' t" S% n, c复染后水洗时间不够        复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

zuming

铁染色$ ], {1 E& d* `8 c* @8 [) S
（Iron stalnlng）
; n$ m' Q( r9 g/ ^( Z. o9 w8 x( L+ p* E$ ]# v
原理：
) J( s! K0 v, G# n! w4 |
+ x2 }, i5 H( W" p# o5 b* g    骨髓中的细胞内外铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁部位。蓝色沉淀颗粒的多少和深浅与细胞内外铁的含量成正比。
, c: x' X1 k3 k! D+ F, I6 m) P
' ~: G4 K. k6 R6 W  e正常细胞反应 :
0 e( O: @. [  T: s$ Z/ {6 v
" W2 e7 Q  C3 n% g! D6 R骨髓铁包括幼红细胞外铁和幼红细胞内铁二部分。/ [: N( E" U2 B2 T! r' p
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细胞外铁正常为 ( 十 )～(++)
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细胞内铁正常为 19～44%幼红细胞阳性 , Ⅰ型为主，少数Ⅱ型。且无环行铁粒幼
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# f9 ]. W( v# P3 e红细胞及铁粒红细胞。5 \1 q! a  P. R/ t) N: ~
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临床评价 :8 H; Q* d9 R/ O/ p

4 G$ a5 v/ U5 G& [* U9 B1. 骨髓铁包括细胞内铁和细胞外铁。细胞内铁为幼红细胞合成血红蛋白时的利用形式, 而细胞外铁是骨髓以含铁血黄素形式存在的贮存铁。骨髓铁染色可了解骨髓中幼稚红细胞对铁利用的功能和铁原料在机体内的吸收与贮存情况, 但外铁在检测时易受到取材、仪器、试剂等因素的干扰, 就其价值来说不及细胞内铁高。
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2. 细胞内外铁减低或消失, 见于铁原料摄入性降低, 铁吸收功能障碍或铁的丢失和消耗过度, 使幼红细胞血红蛋白合成量减少或障碍, 如临床常见的缺铁性贫血及能引起机体缺铁的相关性疾病,如钩虫病、ITP 等均能使机体中细胞内外铁减, 产生贫血症状, 因此对骨髓铁的检测是诊断缺铁性贫血最重要且较早期的指标之一。) C& l/ ~# Q0 v7 E8 h/ \6 k! @
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3. 细胞内外铁增多性疾病见于机体造血功能障碍, 铁利用和转换能力下降或迟缓及外源性含铁物质的多次输入等。临床常见的有:再生障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血、骨髓增生异常综合征、溶血性贫血、白血病等, 均可引起细胞内外铁的增多。! ]- f6 r% o& |5 k+ _$ E
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4. 如将铁染色与血清铁、总铁结合力等检测综合观察, 可了解机体内铁的动态变化, 机体对铁剂治疗的早期效果, 可了解骨髓代偿造血的能力, 所以我们只要严格控制铁染色操作技术, 抓住取材、涂片、染色等几个重要环节, 对结果严格辨认, 就能使细胞内外铁染色在各种贫血的诊断、鉴别诊断中发挥更大作用。  l6 J7 y0 W' ^! _" o

2 s) d* L  j2 }操作步骤：
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, U4 {, X7 C- K8 E    骨髓涂片滴加固定液5～8滴，盖满骨髓膜即可。10分钟水洗待干、备用。将铁染色Ⅱ液缓缓滴入铁染色Ⅰ液内，混匀后放入固定好的骨髓涂片，置入37℃水浴箱内放置60分钟，然后连缸流水冲洗数分钟。核固红复染3～5分钟，水洗待干，镜检。0 x7 x) z6 M* \% |

1 I$ `0 D2 _3 a' |6 q0 J- ?( L结果显示：6 g0 g3 S2 o/ b

6 S# ]2 j- S- y细胞外铁：, y# q; c8 H& y& r

" g0 M4 B( u+ Q& W阴性 —（–）细胞外和细胞间隙中无蓝色沉淀物（无色）。" L- q4 ]4 P2 v' N9 c

) D, _9 g( |1 ^  m4 i阳性 —（+）细胞外和细胞间隙中见少数蓝色颗粒。2 v+ C# K2 t5 @: m! Z

& H7 i3 H/ c* [* ~（++）细胞外和细胞间隙中见较多蓝色铁颗粒和铁小珠。　　　
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（+++） 细胞外和细胞间隙中见很多蓝色铁颗粒和铁小珠。
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8 `6 y0 x. |; n; H% I0 ^（++++）细胞外和细胞间隙中见极多蓝色铁颗粒和铁小珠并可见铁小块。. j- B# c! q$ L% V$ r! p4 p, D
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细胞内铁：
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阴性 —（–）细质内无蓝色沉淀物（无色）
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) K  h" @) z8 G4 E9 b5 ?+ E阳性 —（Ⅰ） 胞质见1～2个蓝色细小颗粒。" `( ]: x$ S( t' N0 C1 ^7 H

7 r9 t8 F  m) Q' k5 J7 P) U5 V（Ⅱ） 胞质见2个以上蓝色颗粒。. W4 s3 X0 M3 t

1 c: ^! {! |. Q（Ⅲ） 胞质见1～4个蓝色粗大颗粒。
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: N9 @; q) G0 i; G# D, f- Y! W' @（Ⅳ） 胞质见5个以上蓝色粗大颗粒。
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注意事项:" o1 x  r5 {/ u" @- g( |

  l9 D: u2 V0 z$ S4 p/ U, {# c1.标本取材要满意。外铁检查要选择含有髓小粒的涂片, 如标本保存得当,陈旧骨髓涂片也可使用。
, C$ x9 M' R' j; b3 O2 t* S" x& @. }: W7 p% d( ]% P0 W* Z9 A, X/ `+ ~# E0 ]
2. 所用载玻片及相关器皿应经去离子水洗涤(至少为双蒸水), 除去载玻片和器皿上可能存有的污染铁, 此点对外铁检测特别重要。  d* H) A- c- D9 v3 r3 }

/ G- @& u% t: K3 j( G3. 试剂要新鲜配置, 如二者混合后试剂颜色变绿则表示受污染不能使用。% h' o3 \( o+ a+ j; o$ m; T( c0 c
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4. 复染时应采用纵向, 一半不复染以利观察细胞外铁, 另一半复染以利观察细胞内铁。在寻找细胞外铁时, 最好能在吞噬细胞体内看到铁颗粒, 其比在细胞外看到铁颗粒更有意义。
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5. 通常计算幼红细胞内铁染色积分时以中晚幼红为主, 原红和早幼红不计入百分比内。为使结果准确,应选择不同的区域和部位仔细观察,避免发生遗漏和差错。9 C1 O0 R6 M  v! S$ n
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6. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。
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7. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。
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8. 观察结果时需注意涂片的部位，最好选择体尾交接处。/ Y# b: \* f( ]7 r2 m. M5 w" [

; k& R- t  \6 C7 f# ^% Z! X常见问题与解决方法：) u( }- [0 ^' w/ E0 x* ], }
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常见问题
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解决方法, T( U( k/ Y# ^
未见阳性或阳性减弱：5 C9 U" q( B# c: H. Y
试剂盒过期         从新购买试剂盒  w& r: X5 X) z! D/ C0 ^0 V
试剂被污染变色         需取新试剂从新配制& b' a: i- v/ |' f
载玻片未洗净标本被污染        取干净玻片从新采集标本$ G& X5 V3 A8 p: h: Y
采用了加有抗凝剂的标本         从新采集标本
8 M4 s& w) T, [6 ?' {* f标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等         采用未被污染的标本重新染色
3 Z* _( }2 `) i3 C试剂配制时Ⅰ液未完全置入Ⅱ液内 Ⅱ液开启时间过长        需取新试剂从新配制
4 K/ o2 i# t9 Q3 H( x试剂配制后未及时使用        需取新试剂从新配制
" |. ^3 A# ?8 ]9 _( q/ ]) i孵育时间或温度不够         调整温度或孵育时间- [3 D' z1 }& s+ V- ?! A3 J0 s* a* i

. i" p- s4 {- F3 W7 n/ _( j: L染色背景太复杂：$ S( ?1 T7 p: `6 y
标本被铁污染         采用未溶血的标本重新染色& F- ?. K5 h, o' G, I3 _( k0 }
背景细胞染色过深        , I( R5 D% P9 c! t1 b7 a
孵育时间太长，若影响观察需另取标本重、新染色
0 t. l! [5 [# e) d染色后冲洗方法不当          A! H# r0 w3 B& t# f0 ^
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟! ~# t* G/ c2 ^  i
复染后水洗时间不够        复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗