染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~

deron

0 c+ H) a, t" a: o, J4 Y" f
! J! u, V) {( \! w
坛子里总是卧虎藏龙的，第一次搞这种集合贴，希望大家鼎力支持。; a3 g$ S7 ~( r
“台盼蓝、瑞氏、茜素红、苏木素、油红、溴酚蓝、HE、碱性磷酸酶、vokosa结节染色、免疫荧光染色、阿尔辛蓝、考马斯亮蓝、ACP染色、AKP染色、Brdu 染色、免疫组化染色、结晶紫……”
6 A0 C9 L  q. w" ?从来没有注意到有这么多的染色剂，自己用到的也是屈指可数，掂量了很久，决心整理出来一份完整资料。! L0 i5 _/ e# r$ o+ K; V% ]; M
希望大家多给资料和意见~

deron

http://v.youku.com/v_show/id_XMTc1MDQxMjU2.html，这里有一个台盼蓝的染色操作视频。

deron

3 `# v3 y. E# R0 I; K

% G* n( |5 h+ Q7 h0 [3 g台盼蓝——检测悬浮细胞存活率
/ k, \, R8 l8 I- p$ J  r3 Y0 I8 i, a5 A; T, `  g
基本性质：台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14），或称台盼兰、锥虫蓝 " m5 t7 U- ]1 B
　　      分子式：C34H24N6O14S4Na4 ) B; ^" S( w7 V" X5 Z/ c% c
　　      分子量: 960.82
" X0 d- H/ g0 I. Z　　      可溶于水（10mg/ml)。: j& ?( T2 _6 g' @. u6 V  W& D
) M4 M) b. \" X, z" N3 }! [# w9 z% @
原理：通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，这被称为染料排除测试（dye exclusion）。
6 q) x6 y1 `" u7 a! t& i1 ^2 t, F* ]4 ~/ ]0 A6 K/ v' a2 u! m
步骤：(来自supergama)3 j: Z/ q5 P0 N0 y, c
1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）: g$ P: Q; \# l7 Y
2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。
9 ^. @* f3 ]$ z% P; ?2 |3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度0.04%）
4 u- L1 ]/ b' N7 z+ D. H4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
9 j4 @6 u9 Q9 C5 B2 l: d5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
/ i; P8 Y; [5 c/ e  I+ r, w) H6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%
! ~/ s! {! I3 p4 I7 R5 ^6 Z* e/ U8 m; N7 N( O( G) i
注意：; ^' `% R& f7 }- h! X
1.台盼蓝染细胞时，时间不宜过长，3分钟以内。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。  E! ^4 T. w, k; W. p
2.充分混匀细胞悬液,保证细胞分散良好，呈单细胞。
( q2 Z8 E8 ]; ?) d! a3.细胞计数时：计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。2个以上细胞团按单个细胞计算，细胞团应<10% 。4 p9 b  a; i( C2 k" C
4. 凋亡小体也有台盼蓝拒染现象，因此该方法不能用于区分正常细胞与凋亡小体。
" K% A5 X* k6 N2 w  I1 b5.台盼蓝有潜在的致癌性，需戴手套操作。2 U+ b8 c4 U2 H8 N( f
6.细胞数较多时，可先拍照再计数。

deron

求战友资料支持，求斑竹威望支持

yuhaoze

Hoechst 33342
4 {& p% }) ?$ I& O# }* ]) r用于凋亡检测的染色剂2 }7 ?9 V6 B# l6 B) h+ \3 L
. Z1 I. A' q( r3 j4 K- e$ k
% s, {! |; j! t% [  t+ H. T
1.html&Oslash; Hoechst 33342，也称bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式为C27H28N6O•3HCl•3H2O，分子量为615.99，CAS Number 23491-52-3。 &Oslash; Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。 &Oslash; Hoechst 33342染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33342也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。 &Oslash; Hoechst 33342的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33342和双链DNA结合后，最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm。 &Oslash; Hoechst 33342溶于水，溶解度可达20mg/ml。 &Oslash; 用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33342工作浓度为0.5-10微克/毫升。荧光染料Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。而PI染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中，即活细胞对PI染料拒染，而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被PI染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。使用说明：1.对于固定的细胞或组织： a.对于细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33342染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33342染色。  b.对于贴壁细胞或组织切片，加入少量Hoechst 33342染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5分钟。  c.吸除Hoechst 33342染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。  d.直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。 2.对于活细胞或组织： a.加入适当量Hoechst 33342染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液，对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。  b.在适宜于细胞培养的温度培养20-30分钟。弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。
' v- z3 G( h' v8 ?' {
) p: C' Q+ k) Y1 r3 b' K海洋哥！！！给我2个威望！！！我就升级啦！！！！！: c9 w: y5 a; Y# Q  Z( @1 M
哈哈哈啊哈

jhu132llh

考马斯亮蓝染色$ }& H8 I& ?2 G1 A0 h( P3 a0 g

! e3 v- `2 L7 D; o, C# J. i配方：
7 Y, x' ~$ G* Y4 a2 M3 D考马斯亮蓝R-250染色液配方如下：; \$ L; C0 w3 i7 r) v
考马斯亮蓝R-250    1g
" h2 F, n! ]: g5 @- ^9 y6 G; q250ml 异丙醇6 G" _7 ]6 I( z
100ml冰醋酸; s) E3 ^9 R2 [( I) \+ i- V, M
加650去离子水+ L, [( t* X# B6 G9 X7 g, ~# g
% k/ a7 X/ b5 C4 K
考马斯亮蓝染色法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）。
8 W( _3 m8 L; i% n
. b. N) B, k8 r& p. J  T染色方法：% a5 ], H7 h6 @+ N2 Q% R
1. 常规染色脱色方法：
6 N) d% y2 u4 u* Ra. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。5 {8 S7 b! [; G, [! b) ~
b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。0 P. O$ n- o; u. Z" U- g
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。8 }8 e! r" N3 j- k. {' ^
c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。- d* K  c8 o) S* d
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。: y% K% {0 M# Z1 N7 Y' ~& `7 s
e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。* f' q  g) u9 _7 a+ s7 x9 ^
注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。. D0 U* \7 c2 q, V# ?4 G
f． 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。. e, U0 d2 ~  T

& f) K# v8 j9 {8 x: b$ O2. 快速染色脱色方法：
, Z; j" `# ?- I% ^a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。+ A$ N: e  A/ x9 p
b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。7 T' c7 ^% _& P+ s$ ?  J
c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。+ e; b1 \" N. n5 x9 s/ J
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
& h' l5 V. u& Q% J, @5 Ae. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。: P4 N! \8 N1 R, D6 u
f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。
* V6 G/ {* V7 s3 ^g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。& ^$ T, k: h5 o' P4 u
h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。6 m8 i. y9 d5 m) z3 ?6 P: ~+ A
另附：常规染色脱色方法耗时较长，但检测灵敏度更高，染色效果更加稳定。快速染色脱色方法通常检测灵敏度略低，并且在微波炉加热的过程中有时会出现暴沸导致凝胶碎裂的情况，需特别注意。另外微波炉加热导致的高温会引起染色液和脱色液中的乙酸的挥发，最好能在通风橱中进行。

jhu132llh

苏木精染色2 |0 O+ N" m  ?, d0 z7 ~4 e
【中文名称】苏木精
9 T% U2 N; v$ ~  U* i【英文名称】hematoxylin;h(a)ematine: k% Q5 U: J4 `& A  \6 e' q; c9 O
【性状】
5 f/ {, k7 S9 v  i( Z5 [' R* U  无色棱形晶体，遇光变红。$ y. }3 b* A0 R5 V+ o0 c+ M) z
【溶解情况】
+ s5 k0 t% T4 E( a) t  Y5 s  难溶于冷水和乙醚，易溶于热水和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。: g+ Z" P8 @/ \7 y# U
【用途】
# K1 F4 C9 c) b# P  一种天然媒介染料。用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花，用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。与重铬盐、铁盐、亚铁盐、铝盐和锡盐等一起可制成各种色淀。在分析化学中用于比色分析、显微镜分析，并用作pH值指示剂，变色范围5.0～6.0，由黄色变紫色。苏木精(hematine)为碱性染料,将细胞核染为蓝色;" J/ D5 P* T& ~; B+ c5 v) R) [
【制备或来源】3 |& X1 S* ?/ b/ z
  由苏木树的木材获得。
4 @, V/ ]. V. C5 U【其他】; C. n- ]5 B" ]5 ~1 i) [1 J4 I% {
  含有3分子结晶水，在100～120℃溶于本身的结晶水中。在水溶液中，特别是在碱溶液中易被空气氧化成红棕色的氧化苏木精。8 c8 z- ?) b0 J$ G, V2 [. M
  常与伊红配合，苏木精将细胞核染成蓝色，而用伊红（署红）将细胞质染成红色。
2 t- C  I. {1 M! p) p/ T" [  溶液要避光保存。
/ Y5 _3 ]% o+ {) Z  M7 X/ {8 K) C5 N' V
配方：2 C3 k* O  n2 e& z% S; W6 e) w) g
苏木精的染色液有很多，如通用的苏木精染色液和各种改良后的苏木精染色液等等。
9 Z( Z1 W6 z, A$ c4 h一，改良的苏木精染色液一
( c( Q$ u1 R# x. _+ v+ u* A4 p   材料 苏木精2g，无水乙醇250ml，硫酸铝10g，蒸馏 水750ml，碘酸钠0.5g，柠檬酸1g。方法 将苏木精溶于无水乙醇，将硫酸铝溶于水，两液混合加热煮沸2min，加入碘酸钠及柠檬酸。优点 此液存放时间长，染色力保持时间长，染色效果好。
$ p! u# \: w- Q/ D" g5 {   用硫酸铝替代钾明矾染液久放也不会产生沉淀、结晶，不用过滤即可使用。此液存放时间长，染色力保持时间长，经过我室比较，使用时间可比哈瑞氏苏木精染液长一倍。1g苏木精配置的染液是哈瑞氏苏木精染液的两倍，更加经济实用。此液染色效果好，染色时间3～8min，特别是染色质显色清晰，但应注意一些染色技巧，配置盐酸酒精分化液时，浓度稍低，一般控制在0.8%左右，分化时间稍短，应在30s之内。氨水配制成1%，返蓝时间要较长，一般控制在1～2min，充分水洗后再进行下面的染色。
0 n" R* c1 f0 A
6 v+ k0 o' J. F) n3 D9 ?二 通用海登汉氏苏木精染色液
3 L# X; U7 {1 L% o0 @: R. e海登汉氏（Heidenhain's）苏木精染色液，又称铁矾苏木精染色液。
9 F" H9 h! D+ ^, I# F配方：甲液（媒染剂）： 硫酸铁铵（铁明矾）2-4g ；蒸馏水100ml （必须保持新鲜，最好临用之前配制）。
9 F+ C1 t% ^8 u7 a乙液（染色剂）：苏木精 0.5-1g ；95％酒精 10ml；蒸馏水 90ml 1 p+ B+ ~* n1 ~# ]4 l+ X
配制步骤：
7 I$ f! g2 u/ T4 N! n( p（1）将苏木精溶于酒精中，瓶口用双层纱布包扎，使其充分氧化（通常在室内放置两个月后方可使用）。
9 t5 m# V, m. T6 _# \* _（2）加入蒸馏水，塞紧瓶口，置冰箱中可长期保存。 0 c- X9 f* g$ x# B/ |
切片需先经甲液媒染，并充分水洗后才能以乙液染色，染色后经水稍洗再用另一瓶甲液分色至适度。 铁矾苏木精染液为细胞学上染细胞核内染色质最好的染色剂，但要注意甲液与乙液在任何情况下决不能混合。8 S3 R' ?% g1 b9 X1 T/ @1 ^( G% d
3 v; l) E7 u" m8 s0 t) V6 n
配方三：苏木精水溶液
4 C+ I$ @* M* l. d' d& Y0.5g苏木精溶入100ml煮沸的蒸馏水中，静置24h后可使用。   u! y+ c% K- h% A2 [. Q

4 F+ |: B- n8 O5 H配方四：代氏苏木精（Delarfield’s haematoxylin）
$ K% C* {  i1 Z甲液：苏木精1g + 无水酒精6ml
" A/ s  W- f) G& h/ T2 a" c0 k乙液：硫酸铝铵（铵矾）10g + 蒸馏水100ml # B+ d3 e$ D' p6 T* L, j9 J% ?
丙液：甘油25ml + 甲醇25ml
& R4 g; J9 E  _' h2 e! P) @分别配制甲、乙两液，将甲液一滴滴地加入乙液中，充分搅拌后，放入广口瓶中用纱布蒙住瓶口，置于温暖和光线充足处7~10天，再加入丙液，混匀后静置1~2月，至颜色变为深紫色后，过滤备用，可长期保存。
) }) s" F1 a1 a! w! a
  b6 |7 {& _3 l: ]配方五：爱氏苏木精（Ehrlich’s haematoxylin） ; o* U. k+ ?# g3 l
苏木精1g + 无水或95%酒精50ml + 蒸馏水50ml + 甘油50ml + 冰醋酸5ml + 硫酸铝钾（钾矾）3~5g。配制时，先将苏木精溶于酒精中，然后依次加入蒸馏水、甘油和冰醋酸，最后加入研细的钾矾，边加边搅拌，直到瓶底出现钾矾结晶为止。混合后溶液颜色呈淡红色，放入广口瓶中，用纱布封口，自然氧化1~2月，至颜色变为深红色时即可过滤备用，可长期保存。
- Y  l' w/ ], y1 D
9 L/ y. f6 H- w; W2 G: m) a$ r0 U0 E* O/ Y
4 d* a% m! R% v
6 j8 r0 F' m) R  b# j
染色方法：
1 \% Y1 e4 z% a3 X. Z0 x$ ~1 s一 石蜡切片的苏木精-伊红染色法' H3 l8 K! `$ F: {% @: T% a6 m
（1）切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。
. |; J  J1 q. P/ ?( G（2）移入二甲苯和纯酒精（1∶1）混合液中5分钟左右（如经二次二甲苯脱蜡，此步可略）。. l( ~3 \/ o9 m5 C
（3）入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5分钟。最后经蒸馏水转入染液。
& M/ }0 r( X9 G( J' A" @+ P（4）苏木精染液染色5～15分钟。、
! u) R1 S0 M- r$ v: Q（5）水洗玻片上多余染液，0.5～1％盐酸酒精（70％酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。' w; X: W, {5 ]  `% e- z+ W
（6）流水冲洗15～30分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。（7）蒸馏水短洗。% Z2 q* C2 ^# @/ v
（8）0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。6 a, E2 _% J2 f$ `2 o2 G/ k5 q
（9）依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。
4 \, H. E; e6 U5 t（10）二甲苯透明（二次），共约10分钟。
3 Z1 `/ m5 s1 H2 I: \' L  C（11）封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。/ O3 [' J- n  g/ ~
) L* |- @7 ]& P3 T: _& X/ b
还有其他很多的苏木精染色的方法，主要是用于对染色体的染色，基本方法都差不多，大家实验室都有我就不啰嗦了。

deron

回复 5# yuhaoze * [% H' ]& m4 C# j; o( Z9 p
3 D6 H) M/ d! F9 g0 m1 l3 l: h
8 J* A: a. R# q. U$ ^
    仁兄格式有些乱，不过刚好看了一篇用Hoechst33342染色的文献，多谢！

yuhaoze

回复 8# deron , g. X0 x3 O! O( w

" A8 p4 O3 V- m& X# @3 q# H
& q! k( y7 |0 l7 u  X    我也是从网上转的，呵呵，不过做凋亡没必要用 hoechst。AO，EB已经很好了，便宜，实惠，好观察，又不用流式。无非有点毒性，注意点就是了。

deron

瑞氏染色液(Wright’s Stain Solution)——细胞形态学染色，实验、临床检验常用! v  M; t+ S5 h! c9 Z2 N, O

$ l  K- S+ r  f/ ~2 j: U简介
& Y* A0 Y3 ~9 L: [4 F" P由碱性染料美蓝(Methylene Blue)和酸性染料伊红(Eosin Y)混合配制而成，也称伊红－美蓝染料。其中美蓝为碱性氯盐，呈色部分为阳离子，阴离子无色；伊红的有色部分为阴离子，阳离子无色，其有色部分为酸性，故习称伊红为酸性染料。
, `2 I1 {6 u" @& t7 i" I. T7 `; j新配制的瑞氏染液染色效果较差，久置, 因其中的美蓝被氧化而含有天青，美蓝天青与伊红能使细胞核染成紫红色，而多余的美蓝则可以使胞浆染成蓝色。化学作用为主，伴有物理亲和反应。
# b( |' z% o% ~+ X% W, M2 E3 }6 I9 H7 o/ `7 O8 H1 D4 @# a
染色原理：
, h/ g$ U5 N- ~各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质。9 W+ z, x2 F) w8 u
原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。
. K, l2 @: i; B- f: i" @7 l  V3 T  I, S% \  L0 }% Q9 B
pH的影响（pH6.4～pH6.8）
. ~8 o0 A) j) b0 O& i- F细胞各种成分均属蛋白质，因蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。- t; B9 m5 G$ V3 ]8 s9 s

: Q( A' k6 L, p6 }& K$ W+ z瑞氏染液的配制：
; i. w8 t* x/ _3 R( m9 t取瑞氏染料1.0g、甲醇600ml、甘油15ml。
% m: s) j4 E& vI液：将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨(至少半小时)，以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油，密闭保存。这便是配制的。
0 {$ P  M! d, S7 m/ p1 ]（新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青愈多，染色效果也就越好。但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发或氧化，同时也可使血细胞染色较清晰）
$ [: O. n) p  `II液：又称磷酸盐缓冲液(PH6.4~6.8)，包含磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH。8 v; ~, T7 K/ o( _$ D: ?+ t. V, `& z0 c

9 C; ?9 k+ V7 ?4 c染色步骤
) G7 j$ i$ |# J0 u) L2 _1. 按常规方法制备血涂片，待血膜干后——$ i- s6 z2 B4 H7 |- f4 F  z
2. 滴加染液，使覆盖全部血膜，30秒至1分钟后滴加等量的磷酸缓冲液（pH6.4~6.8），轻轻摇动载玻片，使缓冲液和染液混合均匀，此时出现一层灿铜色浮膜(染色)。
, a/ J4 K) H3 G/ G& e5 C  B: @3. 染色3～5分钟后，用自来水缓慢从玻片一端冲洗(注意勿先倒去染液或直接对血膜冲洗)，凉干后镜检。
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染色注意事项
: W. Z. x( k% w4 h: P: P" P1.血涂片干透后固定（可以考虑使用多聚甲醛），否则细胞在染色过程中容易脱落。 ! x6 c* N4 m% O8 z% c2 A/ J
2.冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。 + ?; S! y' k8 P3 Y" ~
3.染色过淡可以复染，（可以考虑针对性使用其它染料如苏木素）。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。
' C! N% f. X& z  D" w! ~4.稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色呈色异常，形态难以识别，甚至错误。