染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~

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坛子里总是卧虎藏龙的，第一次搞这种集合贴，希望大家鼎力支持。
% ^/ E/ j% V+ H1 l: g. d8 a* b6 U“台盼蓝、瑞氏、茜素红、苏木素、油红、溴酚蓝、HE、碱性磷酸酶、vokosa结节染色、免疫荧光染色、阿尔辛蓝、考马斯亮蓝、ACP染色、AKP染色、Brdu 染色、免疫组化染色、结晶紫……”
4 C0 R- B: d6 ^3 `' U从来没有注意到有这么多的染色剂，自己用到的也是屈指可数，掂量了很久，决心整理出来一份完整资料。
* g/ |3 e* ^! f! F3 D" k希望大家多给资料和意见~

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http://v.youku.com/v_show/id_XMTc1MDQxMjU2.html，这里有一个台盼蓝的染色操作视频。

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台盼蓝——检测悬浮细胞存活率0 m2 ?- T+ v: C; g, `" m7 E+ N6 q7 o
* q3 ?6 J) Y7 ?: t& Y
基本性质：台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14），或称台盼兰、锥虫蓝
( l' k3 C0 B) [0 C- k　　      分子式：C34H24N6O14S4Na4
: N6 y& p4 d9 l- P　　      分子量: 960.82
8 X3 c# w: |) a6 I9 G. s- M　　      可溶于水（10mg/ml)。
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原理：通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，这被称为染料排除测试（dye exclusion）。
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步骤：(来自supergama)* U- i0 \5 O" E: W
1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）) N, P! M3 @/ x4 J1 I- }
2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。
+ n" l+ ^, F& u0 \5 C  o( V6 ]3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度0.04%）: u' L+ t5 N6 w" p& Q
4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
; g; f5 S4 ^' U  `( i5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。  _! s: ^  T& @) m- W8 t
6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%( f3 P( K2 U* g! v- m7 f. L+ x
: y* r! N9 ?6 X6 ^0 ~/ l0 W
注意：
* F3 |& s3 L9 |# R2 w5 |' K1.台盼蓝染细胞时，时间不宜过长，3分钟以内。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。( P' ~1 u  t* o8 \; h
2.充分混匀细胞悬液,保证细胞分散良好，呈单细胞。
9 s* [. j/ C& \0 f& G" P3.细胞计数时：计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。2个以上细胞团按单个细胞计算，细胞团应<10% 。/ C1 C' e2 u: Z. @7 y  O' b
4. 凋亡小体也有台盼蓝拒染现象，因此该方法不能用于区分正常细胞与凋亡小体。
# C# H" m8 Z% Q: O' t. |5.台盼蓝有潜在的致癌性，需戴手套操作。
5 F9 T) z& n( D3 ~/ s; @/ U6 r6.细胞数较多时，可先拍照再计数。

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求战友资料支持，求斑竹威望支持

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回复 5# yuhaoze
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5 \+ N3 P! `$ U+ t. g7 g    仁兄格式有些乱，不过刚好看了一篇用Hoechst33342染色的文献，多谢！

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瑞氏染色液(Wright’s Stain Solution)——细胞形态学染色，实验、临床检验常用
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$ R4 a. P2 X' M6 o. c9 ^) t# N简介( P' |! O7 }  S$ J
由碱性染料美蓝(Methylene Blue)和酸性染料伊红(Eosin Y)混合配制而成，也称伊红－美蓝染料。其中美蓝为碱性氯盐，呈色部分为阳离子，阴离子无色；伊红的有色部分为阴离子，阳离子无色，其有色部分为酸性，故习称伊红为酸性染料。
( \0 w+ W6 g* _& j/ J6 R. w新配制的瑞氏染液染色效果较差，久置, 因其中的美蓝被氧化而含有天青，美蓝天青与伊红能使细胞核染成紫红色，而多余的美蓝则可以使胞浆染成蓝色。化学作用为主，伴有物理亲和反应。$ I& g0 v8 @2 ]' N( o) E, X
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染色原理：
. s# b( Z( O, m  y2 O+ y各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质。' U  K) N- E; b+ ^8 x3 L6 t( g6 W7 k
原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。
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2 S& y/ |- r* B* Q$ LpH的影响（pH6.4～pH6.8）
) D8 S* U7 o" W. A细胞各种成分均属蛋白质，因蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。
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% {" H7 N3 Y% V6 h# f$ h2 q1 W1 D3 N瑞氏染液的配制：
4 n) g$ g  Z( F. h  M" H1 N取瑞氏染料1.0g、甲醇600ml、甘油15ml。, A8 j& J" G% b7 t% j/ t" d* z# w
I液：将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨(至少半小时)，以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油，密闭保存。这便是配制的。7 n; E% q$ s" a' _# Z" w4 s
（新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青愈多，染色效果也就越好。但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发或氧化，同时也可使血细胞染色较清晰）, i& a6 Q3 k* }$ h* P/ z
II液：又称磷酸盐缓冲液(PH6.4~6.8)，包含磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH。3 P  S( `( z) z6 m2 F, H) r! o' H
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染色步骤+ I% ~( ~5 n3 ]# {" M
1. 按常规方法制备血涂片，待血膜干后——; g- H+ c( y4 [/ l3 |
2. 滴加染液，使覆盖全部血膜，30秒至1分钟后滴加等量的磷酸缓冲液（pH6.4~6.8），轻轻摇动载玻片，使缓冲液和染液混合均匀，此时出现一层灿铜色浮膜(染色)。
1 b5 [- R. @/ w, m; V3 d1 N0 J3. 染色3～5分钟后，用自来水缓慢从玻片一端冲洗(注意勿先倒去染液或直接对血膜冲洗)，凉干后镜检。
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* i& h  W: B$ U4 F: [7 P染色注意事项 3 F, E! U7 B( N/ [. D
1.血涂片干透后固定（可以考虑使用多聚甲醛），否则细胞在染色过程中容易脱落。 " Z0 f% t. b7 s4 |9 H/ h
2.冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。 % G/ d, J5 a6 O% {! @6 v
3.染色过淡可以复染，（可以考虑针对性使用其它染料如苏木素）。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。
0 V) {% v$ C- d' q4.稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色呈色异常，形态难以识别，甚至错误。

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整理资料很累，大家多给些意见，多一些支持

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多谢yuhaoze、jhu132llh、lipd09@mails几位版友的资料，整理结束后我会把完整版给大家传一份。

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接下来介绍吉姆萨染色，论辈分吉姆萨应该是瑞氏他弟，因为吉姆萨的组成为伊红、天青，瑞氏为依红、美蓝，而天青正是美蓝的氧化产物。
  I/ h+ F! D) q; h8 X' I- G* v比较让人不解的是，吉姆萨比瑞氏要来的娇弱一些，它的工作液为了防止二氧化碳酸化，需要现用现配。瑞氏却是在瓶中放置时间越久越好用，不知道坛子里的大虾们有没有能够解释为啥美蓝不怕酸化的。

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吉姆萨染色——瑞氏染色他弟' K5 ]  }$ z% b, B) G5 F

3 i$ V/ `1 t) B9 `染液组分4 f* ]1 _2 M! t& A  O" l4 c
吉姆萨染液由天青，伊红组成。
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染色原理# x& n, e+ v5 a: X( Z; G' J
嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；
+ ~$ x0 z& s2 s/ _细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；
9 w1 G6 ?) V  y0 [中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。9 w$ E7 M- ?( k1 h8 {8 a

3 E; ^& }- |" v9 k+ o染液配制
/ F& }  U; n  K配方一：
+ H1 t# w& j, z1. 取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油中，置于60℃温箱，约3h后溶解。/ G8 S2 `& x+ e3 J
2. 取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶中长期保存。
. u$ @6 D, H- I% j# T3 I* `0 v3. 母液与0.1mol/L的PBS（pH6.9~7.2）按1:9混合即成工作液。工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。
( K, V  v/ i) P% w配方二：, o8 ]2 |( d$ w% M7 \
1. 吉姆萨干粉1.5g，甘油（分析纯）50ml，甲醇（分析纯）50ml。配时先将Giemsa干粉倒入研钵内，加进少量甘油，仔细研磨约半小时，至无颗粒状为止。0 u7 d" M4 b- B' U9 e2 g
2. 把剩余甘油全部倒入研钵内磨匀，然后装入棕色试瓶中，置约60℃温箱中保温2小时，再加入甲醇，混匀后贮存备用。1 |/ n8 D/ X' Z3 t$ {2 S- v8 d6 g$ P
3. 同配方一。
" A( s( K% d% K* ^" \& I2 h9 f配方三：  e3 C! J- m' b+ T
在没有优良吉姆萨染料时可以采用：天青Ⅱ一曙红盐3.0g, 天青Ⅱ0.8g，甘油250ml，甲醇250ml。配时取天青Ⅱ一曙红盐和天青Ⅱ结晶置于干燥器中充分干燥后倒入研钵中加甘油充分研磨，再加入甘油和甲醇，后续过程同配方二。
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; P7 m/ l/ o$ s2 J' u% Q染色程序
. O% c: T9 h' w- v6 ?5 c3 i" n$ `1．标本用甲醇固定5~10min。
$ R5 }2 E" B( F- U" Q, u! b- E5 D2．吉姆萨染色10~15min——可用染色缸或者染液滴覆于标本。: X. g: x& ?# C9 }1 Z. V' a: P
3．自来水冲洗掉红色背景。0 Z' X( E, [' m2 R; I

. f% R1 ^+ P$ o- b注意事项
$ j8 d2 O# x; \, o5 n0 ?" D9 FPH对细胞染色有影响。细胞各种成分均含蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用片必须清洁，无酸碱污染。配制染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常。