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石蜡切片免疫组化染色步骤
: _, ]! O* d. a: _) u1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
0 S, t9 ^1 f. _* Q$ s( a, y1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
# w6 p& {" C) M$ Y- {# v9 T [) T2 y d9 R1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
! L! m2 w1 Y6 [1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
" n8 @( v6 k2 D2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。' J* Y8 f8 X# H y, M8 u
g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。1 L: l& E4 p0 c( h4 K4 J( Z
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
: M: z2 ?& X4 Z% O6 K3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
; l" W4 z+ r5 A* F8 r$ e3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）; L9 E8 O* a5 G( E* o
石蜡切片脱蜡至水。
1 Y- a4 B0 m4 v1 d. d2 o+ T! E: [/ a3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
8 p' m- H' T+ d: T1 b蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。7 b# v, u) I, x0 D' d7 y; P( f
5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
/ u8 S3 S: C, `. a+ w8 jPBS冲洗，5分钟×3次。! M+ c/ j4 Z% i2 K
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 g( E7 \1 r6 S( [+ O0 l5 _
PBS冲洗，5分钟×3次。
) b6 `; D( s. p4 R7 I2 J滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
$ Z- E& ?% Q# c, m8 C/ T9 Y6 c; WPBS冲洗，5分钟×3次。
) z1 z! G2 P; }7 @. t显色剂显色（DAB或AEC）。, D2 V/ H- x; e/ E
自来水充分冲洗，复染，封片。+ a' S- }! j) x- z, B. a8 k$ L
冰冻切片免疫组化染色步骤
Z- m1 ^/ L+ _1 R. Um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。冰冻切片4~89 }) D" `# @6 A* L2 y# }1 w6 E
" L, C% W, u4 l- m X
免疫组化非特异性染色的消除方法 / y1 j" M' o( Q- a% E, @. X
一、非特异性染色的主要因素 8 S, f8 Z' M. z+ b+ ?( g& Z, K! N
组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
- X/ p8 `* [6 x% p, V（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
% O- V; Y( {' y: L。
3 u1 |# R3 F+ m( k) X（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
; A' U! I* ?& x$ p' n/ U; P（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 % \5 O: p# s* p$ T5 I) h
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
5 Z3 L* O" i9 X（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
, a- z6 y$ w2 g7 G8 }6 J* E（6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法 & J+ @. ^$ L) h! }
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种： ' Q) B% J5 R `8 [* J3 \1 l
（一）动物脏器粉末吸收法
" _ O1 r: e" D# a$ }常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。 7 H! |" A: j8 T$ z5 _3 c! }
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
3 _2 F4 g& h+ _" n+ t用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min
) ?# f j" }% ~. m10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。 9 }. Z$ |- t. }% r' K
【肝粉的制法】
* G4 ?8 O' }. }. K, N1 w- {8 Z D. u（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。 , N1 M8 f1 c. m! X
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。 8 t( H8 ?$ N7 ]9 y
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。
2 p/ ^5 P" r+ ~9 e/ w' T（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。 4 I+ m7 x: w7 [/ V; k, i% a7 o& L9 n) G: K
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
+ M" G5 J! f8 Z$ L, b2006-12-22 13:24 wifgw$ x! T( z3 B2 c8 E4 t+ y7 T
二）透析法 6 g3 x% |$ F% p/ I% h) U" G
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。 + V; S& G' F' u4 N" v: f" @- d: l
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。 ' h+ Q9 X7 Q5 O$ d8 q
（2）浸入0.02mol/pH
2 d: M6 l" @. R7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
; `, Z0 F" P6 w1 D. z4 T7 |（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法 , O" v* G* M p) @4 _
除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
( {& e7 ~( ^8 p2 l若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。 . L. h! u* ]% ?
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
6 x* _( W" A/ L, m# k3 B6 e T（四）DEAE纤维素柱层析法
8 ?* g: K3 |9 V) B# Z6 L标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜 9 T8 D9 r! U/ |0 l+ Q
。常用梯度洗脱法如下：
& Z$ h5 S% y( l+ r/ j0 A+ U' q（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液， 4 Y; c7 h" U8 i* {
分别洗脱和收集： 4 w9 w6 }5 w4 ^* P$ `0 B. Q: ~# p
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脱部分1。 : c" o7 g4 E; y: C
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脱部分2。 ) K) | g% H( L& j, c" O+ C
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脱部分3。
4 ^) J+ R% E; i" B% X) E2 R, @将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。 / j+ o( U2 p- y" E
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至
6 w4 U1 g2 |3 ~6 t; C- C2.0mol/L洗脱完。 - Q% F9 j7 w" e
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。 - Z# m/ ~+ @/ @" @- M. `! L$ i" |
（五）荧光抗体稀释法
5 @9 ]" M0 o7 w- G先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。 ~& H1 r" Q7 A% D
（六）纯化抗原法 % q5 A+ w4 r2 O3 F" E3 M9 S& B
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。 7 h: k0 O" s' ~6 _ W I
（七）纯化抗体法---免疫吸收法 9 l; j5 e+ O/ U3 z$ M% P
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：
, p9 k, E% C) P- F9 N, l. C; A4 s1．人IgG聚合物的制备 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
0 a- v' l* r: i- D2 y+ L2 }2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
$ e' L8 q# L" l& k a. j: B) \（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法 & a: S: h8 I z6 z" r# ^" G6 U1 W, g
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以
6 f* b$ J' J9 U和然释荧光抗体。 / u7 x' u3 T. b% ~5 o* u; k. L
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。 |
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发表于 2010-11-25 09:46
