染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~

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碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。     U" E/ r. F6 \
以ALP为目标物的检测方法：  $ u  E3 w$ Y0 V1 S) `
1 Gomori钙钴法  ' H/ E# j5 ^6 j* l+ f% ?$ N
【染色原理】   7 `4 |- H" {' z5 [! o5 L
ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。  - x: S; G; s& V- r
【孵育液配制】  
7 w9 F+ m$ {2 V/ P% h3%β-甘油磷酸钠5ml  0 ?" o6 T) L3 S8 P
2%巴比妥钠5ml  ! ]+ R/ W6 m, }: u  m
蒸馏水10ml  
7 N- `4 C) y1 K) i% ^& x) c2% CaCl2 10ml  
  J' D" g- ~' Q' `. W2% MgSO4 1ml  
; ?0 p  B7 i4 o" y) x6 b  x2 y* Z【步骤】  ' n; l6 m( t7 X4 Z
（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。  
. R" c& R: X$ h0 m4 h2 h（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。  
1 x) G# {1 K. o' t2 |+ T& S（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。  * h+ w' g1 Q# q" f+ w
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。  
! [, P- E$ {: P4 x: b2 X' D（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。  
$ v9 V4 {$ R) c' G  P( u! O8 A9 Y【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。  
( c9 O! W+ W  q5 {- _) I) W- M
) l1 B+ R! L& @# H8 @6 O2 偶氮偶联法：  
3 e6 P0 Y& G" e2 t【孵育液配制】   
0 K- Q, [7 K# L0 o萘酚AS-BI磷酸盐 20mg  6 \; d3 B  \6 ^+ K) i) L3 l* p/ E& f
DMSO 0.5ml  + Z2 E# B# ?# x) e* ]2 i' @: ]
0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml  
2 u, t% Q. N1 }* e六偶氮副品红0.5ml  
! L9 }8 z, H6 s% Q1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。  5 _( @8 m+ F" [0 Y( c  u) k! v
（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）  
+ E: y, H: Z8 R0 j  O1 P  U' }【步骤】  
* x/ Z& C3 i0 b+ D& r* g8 n（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。  
( o  n5 z" m9 q; C; E4 x: E+ u1 T$ a5 P（2）蒸馏水冲洗。  
+ J' V5 Q  f( L( i2 @4 _4 E（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。  
: {" e: M* C9 u6 m1 u* N（4）流水冲洗，晾干。  + [- J4 w8 i/ P( ~! }
（5）甘油明胶封固。  
! \4 d+ G" v5 V! |7 g, R2 _! u【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。  
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" H. ~8 m- `5 d6 E3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：  
7 W# S" \* L3 T5 }# j: @# x" T【作用原理】 细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。  . k6 E3 l1 E5 f+ q5 l
【作用液配制】  
1 I6 ]) Q# W1 ?8 \$ t取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。  
% Z( h; q9 S4 e% c' V- `+ G( l6 l【步骤】  
! h+ H# O: F5 @) [: ^6 P（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。  - s( `6 y' H3 }3 Y; a
（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。  : ?4 I) D3 I& f% N% t
（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。  / A5 i0 W5 c* y; e; O, M" J! T$ e( t, ?
【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。  
% ]3 D# O9 H  g8 U. O' T3 h" E7 {4 i% x! Q1 N

# O# y) w5 |* K. ]针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：  0 H( S$ M: M7 u& O/ _4 R
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4 茜素红法  
2 d2 S' S" f( C/ [" R( c/ `【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。  4 h; \+ V! z& I2 j- }) v
【步骤】    w# h8 y8 _# \) M) R' T% J
（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。  ( j! R" W, l0 G% i/ U( i% J1 _5 X
（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。  9 R- M8 a" Z; v) C7 E$ v3 u/ p. r
（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。  6 c' c% o) q( j) O! ], i- H
【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。  1 j# K$ p2 b7 l% D3 Z) q" A" }
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5 von Kossa法  
; v' k' Z' K) ~1 o# j( m【作用原理】  + Q. `2 n8 r' a% U; z! g# G
Von Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。  
5 T1 u% T0 j, e  H! b+ P【步骤】  8 i' Z2 A. V/ M: ~+ _$ l  k
（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。  
$ A3 P  O9 a4 t$ W; J; @（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。  ( h; W6 i, L' t" ]
（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。  2 T& x: W& u8 j) I
（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。  
2 W" [( k5 b0 E" N（5）室温下晾干，封固。