染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~

wang2004k2006

Hoechst 33258细胞核荧光染色液4 w1 n" `1 K* ]6 ?4 t* u) v& w
用于支原体检测
2 `+ a- m! `& o9 y; ~Hoechst 33258，也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式为C25H24N6O•3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4 。Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。 Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。 Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。
' p+ y9 `; y5 D6 q/ }8 l$ m溶液配制：二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst 33258）浓缩液：称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank’s 平衡盐溶液中，在室温用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，－20℃避光保存。二苯甲酰胺荧光染料工作液：无酚红和碳酸氢钠的Hank’s溶液100ml中加入二苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml，混匀，临用现配，此液对光和热敏感。( u: F% i1 r1 K6 [: `3 E1 }
试验步骤
/ I4 B5 `2 i6 h% ]1 取培养的Vero细胞经消化后，制成每1ml含105的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板，每孔再加无抗生素培养基3ml，于5%二氧化碳孵箱37℃培养过夜，备用。
3 z6 w) E1 C6 q0 b2 于制备好的指示细胞培养板中加入被检样品，置5%二氧化碳孵箱37℃培养3天。取上清接种到制备好的细胞培养板上培养3天，末次制备好的细胞培养板含盖玻片。吸出培养孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟，吸出固定液，再加5ml固定液固定10分钟，吸出固定液，加二苯甲酰胺荧光染料工作液5ml，加盖，避光室温放置30分钟，吸出染液，每孔用纯化水5ml洗3次，吸出水（一定要吸干净，特别是玻片边缘部分一定要吸干净），盖玻片于空气中干燥（彻底干燥），取洁净载玻片加封片液一滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。
, J: |5 Y1 t1 H  ]& O3 用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
7 w! ~6 [/ z$ V* {/ G" U4 用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳性对照。* g8 G' j& y6 I  v) O: l2 a* @! J
结果判定
2 \- ]; w8 [, l阴性对照：仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。  C1 y( J  M9 }+ D, @# o7 a8 o
阳性对照：荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。* R1 y5 c. H& F- x  T  A2 f" y
当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。3 J1 l9 ?1 k% N
如供试品结果为阴性，则供试品判为合格；如供试品结果为阳性或可疑时，应进行重试；如仍阳性时，供试品判为不合格。

wang2004k2006

阴性对照显色的只有细胞核，呈黄绿色是于所用的荧光显微镜有关，我用国产的显微镜是显黄绿色，奥林巴斯的是显蓝色。阳性菌株中大小不等不规则的荧光着色颗粒就是检测到的支原体，如果污染支原体严重的话就是呈棉花一样的絮状物。