细胞免疫荧光

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我准备做细胞免疫荧光染色，步骤咋样，有什么需要注意的？谢谢

jhu132llh

http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724! x) ]1 a0 {1 r" S  `' W3 s* c7 J
前两天我回的帖子
/ ]' g% ]1 ^9 Q希望对你有用。4 j+ m0 A6 O9 N" x
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做细胞的免疫组化步骤：
" T+ T% D, K: U/ g$ C1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色8 N( l7 ]% Q: X& a$ ~1 a
     细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片
# v% u: |' j; N  d    细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
/ ]4 @8 k0 G5 }8 [' j6 p    其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。
/ l0 C0 b, w: Y  K: s2.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。& q' P! O. q9 n. g! t
3.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。0 R* T* Q1 w8 s, k: K: ?" h
3.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。4 u) S2 `& g' g6 T: \1 o
4.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。' d1 G! t( {4 d5 p- f) \& d) ?
5.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。$ T/ }1 `/ B. K
6.洗去一抗。
9 P/ v- n6 M" C# |; ^3 v7.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。# B, ~( A  J9 L
8.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）
8 P% u- Y8 O1 ~! _9.洗去二抗，染核" T' P: b  @' ~# h& m
  DAPI或者Hoechst染核: }4 v8 G$ K! ^# k: ?) j3 q
10.洗去染核液，加PBS，上镜观察。
  P) @/ ]9 n- X. `2 D3 J; M
6 q; P$ j# j% h1 ]  Q% N; Y+ g本文来自干细胞之家  - 中国干细胞研究员的交流论坛，http://www.stemcell8.cn，详情请看：http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724

guiguzhencao

谢谢 多交流

宥宥自得

上次试验中封闭后还洗了，结果出现了假阳性，应该跟这有关，下次试验改进。多谢！

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谢谢交流！