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前两天我回的帖子; [6 O7 \' C/ y+ Q- {. ]
希望对你有用。" @6 A* [0 k- k2 B2 o
- e+ f9 S1 q7 f做细胞的免疫组化步骤:' i8 o; v% n" ]. j( y: J1 X
1.片子的制作:可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在24well/12well/96well中直接染色
7 K$ |$ V/ r. a' P8 m; \/ Z, V 细胞爬片的制作:直接购买公司的已经处理过的细胞爬片,要是自己制作的话,就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片" L4 q2 f% ?( i$ H3 z) b
细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
3 v) l( l3 W9 Z8 \ 其实小的well的话,可以直接拿来染色,没问题的。
9 L4 T1 B$ j: X* }! q9 b2.固定:用PBS洗去培养液,用固定液(如甲醇和丙酮;4%多聚甲醛;酒精。。。)固定细胞。5 G% r& I" V9 N3 c; |- f( U- s
3.内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞(选作,二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染色不用做)。
& F! Y& g; S( H+ C, D' Q3.通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做;细胞膜蛋白不需要做),一般选用Triton-X100来做细胞通透,浓度和时间需要摸索,一般是0.1-5%,处理时间为1-30分钟,级个别需要到1-2小时。
: s: g0 l. n1 `# l; m7 G6 f4.封闭:洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时,也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗,直接上一抗。
: ]1 I; C; ^' m8 m5.一抗:具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体,但是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液可以购买抗体公司现成的,对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。. D/ }' C! }2 s& z4 O" E
6.洗去一抗。
( m& }: {) s* D1 I; x7.上二抗,二抗一般抗体公司会给你推荐的,你在其中选上一个就行了,自己选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗,二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
' w4 R; ^0 @' k3 B* d8.底物显色(选作,二抗连得是酶的必做,按试剂盒的说明书添加就行了,显色时间可能需要摸索,以免显色过度引起假阳性;二抗连得是荧光报告的不用做)$ { h/ O5 N$ a* C4 G1 T( C
9.洗去二抗,染核4 q1 I$ _5 Q! j, b7 K- Z
DAPI或者Hoechst染核) y3 U/ R2 G. M& c$ r% \ Y
10.洗去染核液,加PBS,上镜观察。 1 Z5 W& e0 _. x% [; J5 r
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