细胞免疫荧光

stylelife

我准备做细胞免疫荧光染色，步骤咋样，有什么需要注意的？谢谢

jhu132llh

http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=307241 X8 w" b6 {0 [; O' X. L8 u
前两天我回的帖子; [6 O7 \' C/ y+ Q- {. ]
希望对你有用。" @6 A* [0 k- k2 B2 o

- e+ f9 S1 q7 f做细胞的免疫组化步骤：' i8 o; v% n" ]. j( y: J1 X
1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色
7 K$ |$ V/ r. a' P8 m; \/ Z, V     细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片" L4 q2 f% ?( i$ H3 z) b
    细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
3 v) l( l3 W9 Z8 \    其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。
9 L4 T1 B$ j: X* }! q9 b2.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。5 G% r& I" V9 N3 c; |- f( U- s
3.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。
& F! Y& g; S( H+ C, D' Q3.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。
: s: g0 l. n1 `# l; m7 G6 f4.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。
: ]1 I; C; ^' m8 m5.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。. D/ }' C! }2 s& z4 O" E
6.洗去一抗。
( m& }: {) s* D1 I; x7.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
' w4 R; ^0 @' k3 B* d8.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）$ {  h/ O5 N$ a* C4 G1 T( C
9.洗去二抗，染核4 q1 I$ _5 Q! j, b7 K- Z
  DAPI或者Hoechst染核) y3 U/ R2 G. M& c$ r% \  Y
10.洗去染核液，加PBS，上镜观察。 1 Z5 W& e0 _. x% [; J5 r
8 y  H1 a1 @6 }+ I9 S1 H! p* C, F
本文来自干细胞之家  - 中国干细胞研究员的交流论坛，http://www.stemcell8.cn，详情请看：http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724

guiguzhencao

谢谢 多交流

宥宥自得

上次试验中封闭后还洗了，结果出现了假阳性，应该跟这有关，下次试验改进。多谢！

stylelife

谢谢交流！