细胞免疫荧光

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我准备做细胞免疫荧光染色，步骤咋样，有什么需要注意的？谢谢

jhu132llh

http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=307241 h. O! C4 T3 V# k9 i0 S' Q
前两天我回的帖子
- X' M% w& |* M3 O希望对你有用。- S" u& _/ V" O; C1 F! a8 S

% t) E: F5 M! G1 X2 Q做细胞的免疫组化步骤：
7 F0 r  L7 h7 M/ p1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色
: a' W: N" i( x/ X5 A6 G' g, s     细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片  A7 `" }+ B. M+ r" C  {/ S
    细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。6 P! o  T; Y: F' E, e$ H3 O
    其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。/ q$ Y" C1 U) O  U4 J* i0 H6 P9 r  D) z
2.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。3 i6 G/ M( b6 D. T$ w9 b
3.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。1 T+ U# A8 ]% h5 m% t
3.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。4 `. _( W) _* \
4.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。1 X; ]& E& F% n. C8 m" G- H
5.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
; w( ~' I6 N0 h; b6.洗去一抗。2 {3 X, m( B; C* a+ ~
7.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
0 p+ D; v/ M/ l8 \- \8.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）! f6 p. E4 N: I! F% P, S" ?
9.洗去二抗，染核
" w! }- Q" ^0 U1 z9 v: {$ [, e  DAPI或者Hoechst染核# K  X2 z( c" I
10.洗去染核液，加PBS，上镜观察。
2 _) r# U! w% g) i' }# q% K! r' I2 E: v7 b
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guiguzhencao

谢谢 多交流

宥宥自得

上次试验中封闭后还洗了，结果出现了假阳性，应该跟这有关，下次试验改进。多谢！

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谢谢交流！