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前两天我回的帖子
- X' M% w& |* M3 O希望对你有用。- S" u& _/ V" O; C1 F! a8 S
% t) E: F5 M! G1 X2 Q做细胞的免疫组化步骤:
7 F0 r L7 h7 M/ p1.片子的制作:可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在24well/12well/96well中直接染色
: a' W: N" i( x/ X5 A6 G' g, s 细胞爬片的制作:直接购买公司的已经处理过的细胞爬片,要是自己制作的话,就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 A7 `" }+ B. M+ r" C {/ S
细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。6 P! o T; Y: F' E, e$ H3 O
其实小的well的话,可以直接拿来染色,没问题的。/ q$ Y" C1 U) O U4 J* i0 H6 P9 r D) z
2.固定:用PBS洗去培养液,用固定液(如甲醇和丙酮;4%多聚甲醛;酒精。。。)固定细胞。3 i6 G/ M( b6 D. T$ w9 b
3.内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞(选作,二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染色不用做)。1 T+ U# A8 ]% h5 m% t
3.通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做;细胞膜蛋白不需要做),一般选用Triton-X100来做细胞通透,浓度和时间需要摸索,一般是0.1-5%,处理时间为1-30分钟,级个别需要到1-2小时。4 `. _( W) _* \
4.封闭:洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时,也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗,直接上一抗。1 X; ]& E& F% n. C8 m" G- H
5.一抗:具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体,但是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液可以购买抗体公司现成的,对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
; w( ~' I6 N0 h; b6.洗去一抗。2 {3 X, m( B; C* a+ ~
7.上二抗,二抗一般抗体公司会给你推荐的,你在其中选上一个就行了,自己选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗,二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
0 p+ D; v/ M/ l8 \- \8.底物显色(选作,二抗连得是酶的必做,按试剂盒的说明书添加就行了,显色时间可能需要摸索,以免显色过度引起假阳性;二抗连得是荧光报告的不用做)! f6 p. E4 N: I! F% P, S" ?
9.洗去二抗,染核
" w! }- Q" ^0 U1 z9 v: {$ [, e DAPI或者Hoechst染核# K X2 z( c" I
10.洗去染核液,加PBS,上镜观察。
2 _) r# U! w% g) i' }# q% K! r' I2 E: v7 b
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