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细胞免疫荧光 [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2010-11-26 15:09 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
我准备做细胞免疫荧光染色,步骤咋样,有什么需要注意的?谢谢
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沙发
发表于 2010-11-26 15:54 |只看该作者
http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724+ V. ~. ]- Y8 w1 w# q
前两天我回的帖子
; E) z* `1 t1 t: B希望对你有用。3 i' _" o1 Y; L5 t

# a0 C& N# v" u1 p9 f做细胞的免疫组化步骤:
  u$ M2 e' P6 \: g1.片子的制作:可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在24well/12well/96well中直接染色
7 t. }0 n9 @" |+ W! E     细胞爬片的制作:直接购买公司的已经处理过的细胞爬片,要是自己制作的话,就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片( x7 d. t% _1 Q' Z
    细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。" [, P& E: {8 ]; W
    其实小的well的话,可以直接拿来染色,没问题的。
. {3 v9 o# j$ J% T/ r( L! A2.固定:用PBS洗去培养液,用固定液(如甲醇和丙酮;4%多聚甲醛;酒精。。。)固定细胞。& q/ K+ s( h/ e, e* l1 J
3.内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞(选作,二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染色不用做)。; u0 N, }. B/ z" k4 O
3.通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做;细胞膜蛋白不需要做),一般选用Triton-X100来做细胞通透,浓度和时间需要摸索,一般是0.1-5%,处理时间为1-30分钟,级个别需要到1-2小时。
, w( ^) @- H) |! |4.封闭:洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时,也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗,直接上一抗。% i2 f: X/ x7 k- D6 ]/ z
5.一抗:具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体,但是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液可以购买抗体公司现成的,对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。5 A9 {& y8 f# S9 k  p9 Q5 }, @2 }" @
6.洗去一抗。
! J$ n1 ]: q( _7.上二抗,二抗一般抗体公司会给你推荐的,你在其中选上一个就行了,自己选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗,二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
2 Q0 A- S$ J3 O& T8.底物显色(选作,二抗连得是酶的必做,按试剂盒的说明书添加就行了,显色时间可能需要摸索,以免显色过度引起假阳性;二抗连得是荧光报告的不用做)
; U' h' j6 W6 G7 w0 D, F9.洗去二抗,染核
, u1 \. {* R6 t, {& }; `( p$ k  DAPI或者Hoechst染核
, L9 e3 C+ ?% V5 I10.洗去染核液,加PBS,上镜观察。 6 s& I% P5 A/ @7 m! L( j( x

% @+ g/ t+ Q; i; x本文来自干细胞之家  - 中国干细胞研究员的交流论坛http://www.stemcell8.cn,详情请看:http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724
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藤椅
发表于 2010-11-26 16:07 |只看该作者
谢谢 多交流

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积极份子

板凳
发表于 2010-11-28 11:09 |只看该作者
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上次试验中封闭后还洗了,结果出现了假阳性,应该跟这有关,下次试验改进。多谢!
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报纸
发表于 2010-11-29 11:44 |只看该作者
谢谢交流!
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