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前两天我回的帖子
/ ]' g% ]1 ^9 Q希望对你有用。4 j+ m0 A6 O9 N" x
4 i) B2 k% j. ~! c; N; x) B8 ^
做细胞的免疫组化步骤:
" T+ T% D, K: U/ g$ C1.片子的制作:可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在24well/12well/96well中直接染色8 N( l7 ]% Q: X& a$ ~1 a
细胞爬片的制作:直接购买公司的已经处理过的细胞爬片,要是自己制作的话,就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片
# v% u: |' j; N d 细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
/ ]4 @8 k0 G5 }8 [' j6 p 其实小的well的话,可以直接拿来染色,没问题的。
/ l0 C0 b, w: Y K: s2.固定:用PBS洗去培养液,用固定液(如甲醇和丙酮;4%多聚甲醛;酒精。。。)固定细胞。& q' P! O. q9 n. g! t
3.内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞(选作,二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染色不用做)。0 R* T* Q1 w8 s, k: K: ?" h
3.通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做;细胞膜蛋白不需要做),一般选用Triton-X100来做细胞通透,浓度和时间需要摸索,一般是0.1-5%,处理时间为1-30分钟,级个别需要到1-2小时。4 u) S2 `& g' g6 T: \1 o
4.封闭:洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时,也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗,直接上一抗。' d1 G! t( {4 d5 p- f) \& d) ?
5.一抗:具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体,但是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液可以购买抗体公司现成的,对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。$ T/ }1 `/ B. K
6.洗去一抗。
9 P/ v- n6 M" C# |; ^3 v7.上二抗,二抗一般抗体公司会给你推荐的,你在其中选上一个就行了,自己选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗,二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。# B, ~( A J9 L
8.底物显色(选作,二抗连得是酶的必做,按试剂盒的说明书添加就行了,显色时间可能需要摸索,以免显色过度引起假阳性;二抗连得是荧光报告的不用做)
8 P% u- Y8 O1 ~! _9.洗去二抗,染核" T' P: b @' ~# h& m
DAPI或者Hoechst染核: }4 v8 G$ K! ^# k: ?) j3 q
10.洗去染核液,加PBS,上镜观察。
P) @/ ]9 n- X. `2 D3 J; M
6 q; P$ j# j% h1 ] Q% N; Y+ g本文来自干细胞之家 - 中国干细胞研究员的交流论坛,http://www.stemcell8.cn,详情请看:http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724 |
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