细胞免疫荧光

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我准备做细胞免疫荧光染色，步骤咋样，有什么需要注意的？谢谢

jhu132llh

http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724+ V. ~. ]- Y8 w1 w# q
前两天我回的帖子
; E) z* `1 t1 t: B希望对你有用。3 i' _" o1 Y; L5 t

# a0 C& N# v" u1 p9 f做细胞的免疫组化步骤：
  u$ M2 e' P6 \: g1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色
7 t. }0 n9 @" |+ W! E     细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片( x7 d. t% _1 Q' Z
    细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。" [, P& E: {8 ]; W
    其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。
. {3 v9 o# j$ J% T/ r( L! A2.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。& q/ K+ s( h/ e, e* l1 J
3.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。; u0 N, }. B/ z" k4 O
3.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。
, w( ^) @- H) |! |4.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。% i2 f: X/ x7 k- D6 ]/ z
5.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。5 A9 {& y8 f# S9 k  p9 Q5 }, @2 }" @
6.洗去一抗。
! J$ n1 ]: q( _7.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
2 Q0 A- S$ J3 O& T8.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）
; U' h' j6 W6 G7 w0 D, F9.洗去二抗，染核
, u1 \. {* R6 t, {& }; `( p$ k  DAPI或者Hoechst染核
, L9 e3 C+ ?% V5 I10.洗去染核液，加PBS，上镜观察。 6 s& I% P5 A/ @7 m! L( j( x

% @+ g/ t+ Q; i; x本文来自干细胞之家  - 中国干细胞研究员的交流论坛，http://www.stemcell8.cn，详情请看：http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724

guiguzhencao

谢谢 多交流

宥宥自得

上次试验中封闭后还洗了，结果出现了假阳性，应该跟这有关，下次试验改进。多谢！

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谢谢交流！