细胞免疫荧光

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我准备做细胞免疫荧光染色，步骤咋样，有什么需要注意的？谢谢

jhu132llh

http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=307244 s' J3 M5 i) t. }( \4 o( O
前两天我回的帖子: C6 n- ^6 i! s0 }9 H4 Q
希望对你有用。; G& x$ H8 h0 i
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做细胞的免疫组化步骤：! B8 d7 e4 O. `" b
1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色, W) [; u  K* F7 w8 Z: T
     细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片4 R" D1 P1 E; N8 y
    细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。. S' v8 R6 R5 ~) o; C% m
    其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。
% B. d( h5 h0 B( v2.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。  D% J0 \7 ]6 \
3.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。
+ ~' }$ G! Z4 h/ B! f, j* @# D+ y( f3.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。
/ e# H. I, L/ A$ O7 [4.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。) I  S* f1 ^1 m( S7 J3 @
5.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。$ x. I6 K" D/ v; D
6.洗去一抗。1 ~6 g; j0 c. F. Y8 q' M3 ~
7.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
/ V4 J% `1 c" i* s& o/ W8.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）# z" S; U: A6 S* a( k
9.洗去二抗，染核
5 D+ ?+ m" W/ J) ?- u$ D  DAPI或者Hoechst染核
( o5 I6 E' b) V+ O9 m4 a: D10.洗去染核液，加PBS，上镜观察。 " g$ s& G( B; m, q9 g

7 F3 i6 i6 ~/ k' H0 o/ n本文来自干细胞之家  - 中国干细胞研究员的交流论坛，http://www.stemcell8.cn，详情请看：http://www.stemcell8.cn/viewthread.php?tid=30724

guiguzhencao

谢谢 多交流

宥宥自得

上次试验中封闭后还洗了，结果出现了假阳性，应该跟这有关，下次试验改进。多谢！

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谢谢交流！