求助：干细胞传代后逐渐死亡，望高手帮忙指点啊！！

stefan

5 |9 G/ D! d7 ^* {# M2 c- x& T. X% d% {
做骨髓间充质干细胞培养已经快3个月了，一直不顺利啊，前一段时间不是养不出来就是遇到污染的问题，现在养出来了吧，传代后细胞逐渐死亡，不知道是什么原因，我自己感觉可能是由于自己传代时胰酶量有点大，对细胞损伤太大所造成的。下面是我的操作，请大家给点建议！！
* f, ]8 L8 M6 q     原代细胞培养10天左右，待细胞铺满瓶底70%左右传递一代细胞。1：1传代（由于细胞呈团簇聚集，有的地方细胞多有的从地方细胞少，所以我没等到80-90%时传代，直接到70%左右就传代了，这点不知道传代时机对不对，大家给点建议！）传代后3天后首次换液，以后3天左右换液，直到细胞铺满瓶底80%左右传第二代，第二代按1：2传代，然后又是3天左右换液，如此重复。当我传到第二代细胞后，细胞逐渐死亡，每次换液前可见有细胞漂浮，换液后细胞量就逐渐减少。我用的胰酶浓度是0.25%+EDTA，Hyclone 的，都是在常温下消化，每次消化1-2分钟，当我每次加完胰酶后直接到镜下观察，即可可见细胞已经变圆，然后立即用含10%胎牛血清的培养基终止消化，然后拍打瓶体，直到细胞漂浮起来，然后1000转离心5分钟离心2次，然后吹打细胞接种到培养瓶中，以后每3天左右换液。
* v  {/ U! Q) k1 R   不知道我以上的操作对不对，我感觉是不是胰酶浓度过大造成细胞损伤太大，请各位指点！！下面是我细胞的照片：" F: Q" M* O! x# L+ S: t  j; E- H- W
   1原代细胞图片，传代前细胞分布不均匀8 S7 n& b- t; p& ^- c
8 B; I/ v- n& }4 f
; F) Q6 c7 k$ f# N7 W6 e
2第一代细胞# g! [! Y7 y% Q0 h& w& W
[img]
* M3 r# I0 f7 S9 x* N% C第一代细胞传代前细胞情况，我是以这个密度传代的， 不知道合不合适！细胞形态也发生了改变！
9 y5 ^+ u# K" Y  f1 u5 `0 M, @) u5 E, k% h8 a; K

! ^  U: t8 v. H这张是高倍镜下的图片！细胞形态和原代有差别，不知道有没有老化的趋势！！
7 O: u! i" ?3 E& p* a5 @( P[/img]+ G+ d# A" U8 i- c  N
8 w9 _+ c/ x# p" c( ]

6 ^/ w& C; ]  Y( Z& `) p, z3第二代细胞% [5 g  d4 F9 V/ C( ~6 S
[img]
0 s  D: b) u. O2 {- k第一代细胞传代后3天的照片，细胞就逐渐死掉了！& i1 I  c0 X' \) l( f% f: f
3 p2 F8 {+ B: d1 R( _# M; d; D
8 ~4 w% b; x) t' _+ A) M
高倍镜下图片！
- J  K; `: a8 j* i' k( ^[/img]

stefan

谢谢各位的指点，收获颇多，改进传代方法和传代时间后再看看情况，准备把胰酶浓度改为0.05%试试，然后就是传代时间准备提前看看。有好的结果后再来报告！还有就是细胞老化是一直困扰我的问题，看论坛中的同道也遇到同样的问题，不知道各位能有什么建议尽量减少细胞老化啊？望指点！！