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作者：赵庆斌作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院： 老年内科，心内科，陕西 西安 710061
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0 p. d8 v8 ^% C+ A4 X 【摘要】 目的: 探讨兔冬眠心肌模型外周血骨髓干细胞的变化及缺血心肌组织中血管内皮生长因子基因表达的变化. 方法: 选用雄性日本大耳白兔为研究对象，通过开胸不全结扎冠状动脉左前降支方法建立冬眠心肌动物模型. 将成功制备的24只兔模型随机分为4组，即缺血3 d组、缺血7 d组、缺血28 d组和假手术对照组. 应用流式细胞术测定各组模型动物外周血单个核细胞中CD34 细胞百分率，应用实时荧光定量PCR方法测定各组动物模型缺血心肌组织中血管内皮生长因子mRNA表达. 结果: 兔冬眠心肌模型于手术后出现骨髓干细胞动员，1 wk内达高峰，随时间延长逐渐减弱；同时相应地出现手术后1 wk内缺血心肌组织中血管内皮生长因子mRNA表达明显升高，随时间延长表达逐渐降低. 结论: 冬眠心肌可通过组织局部血管内皮生长因子表达增高而动员骨髓干细胞进入外周血. : i1 g D4 U9 n/ k
【关键词】心肌顿抑 骨髓干细胞 动员 血管内皮生长因子 [1 Y! _* e7 k5 y8 [
0引言
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干细胞治疗缺血性心脏病在动物实验和小规模临床试验均取得了很大进展［1-2］. 目前这方面的研究主要集中在两方面，即急性心肌梗死和心肌梗死后慢性心衰，这两方面均属于冠心病的严重类型和晚期阶段. 冬眠心肌属于存活心肌，大多存在于冠心病的早期阶段即未发生心肌梗死时，此时同样存在心肌缺血和局部微环境的改变. 本研究以兔冬眠心肌模型为研究对象，探讨心肌冬眠状态下外周血骨髓干细胞的变化及心肌组织中血管内皮生长因子（VEGF）基因表达的变化，为干细胞移植治疗冬眠心肌提供理论基础.
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1材料和方法
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0 Q g# F9 s6 N0 G, R# ] 1.1材料兔淋巴细胞分离液购于北京普利莱基因技术有限公司；CD34单克隆抗体及阴性对照购于B.D公司；RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒购于Fermentas公司；SYBR ExScriptTM RTPCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；Trizol购于Invitrogen公司. Beckman Coulter公司流式细胞仪和美国BioRad公司iQ5型 Real Time PCR仪分别由西安交通大学医学院实验中心和第一附属医院心内科提供. 选用雄性日本大耳白兔30只，体质量2~3 kg，购于西安交通大学医学院实验动物中心. 实验前，实验动物在动物中心适应性喂养1 wk.
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1.2方法
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" P2 S9 N7 r$ ~, Q& b) n9 v 1.2.1兔冬眠心肌模型制备和分组日本大耳白兔30只，30 g/L戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉麻醉. 随后经耳缘静脉注射利多卡因（1 mg/kg），以预防冠状动脉结扎过程中发生室性心律失常. 将兔仰卧位固定于手术台上，备皮，沿胸骨左缘剪断左侧第3~4肋软骨，暴露纵隔和心脏，保持两侧胸膜完整，距左冠状动脉冠状窦开口4~5 mm处，用50无损伤带针缝合线穿过左前降支下方，将直径分别为0.8 mm和0.1 mm的粗、细丝线各一根置于左前降支前缘，将丝线与左前降支一起结扎，随后迅速抽出细丝线，相当于血管90%狭窄. 观察左前降支远端血管充盈不明显，左心室前壁和心尖部心肌颜色稍变暗，表明结扎成功. 假手术组将缝合线穿过左前降支下方，但不结扎. 术后常规饲养，肌肉注射青霉素（40万U/只）3 d预防感染. 术中及术后2 d内共死亡6只，均为模型组，原因为气胸和失血过多. 术后第3 d对实验兔行超声心动图检查，观察左室前壁出现节段性运动障碍，未出现心肌梗死征象，提示手术成功. 将存活的24只兔随机分为缺血3 d组，缺血7 d组、缺血28 d组和假手术组，每组6只.( [0 j3 a S% l7 {6 |* _2 |. E: a" }
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1.2.2外周血单个核细胞中CD34 百分率测定各组每只兔耳缘静脉取血5 mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞. 取2106个细胞，分别加入10 μL CD34单克隆抗体和荧光素藻红蛋白标记（阴性对照），室温避光孵育20 min，用流式细胞仪检测外周血中CD34 细胞百分率.
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" X# T% l) b- b; A 1.2.3缺血心肌组织中VEGF mRNA表达(1)引物设计：根据美国国立图书馆基因数据库(Genebank)检索VEGF基因序列，应用软件Primer 5.0设计引物，由北京三博远志生物公司合成引物. VEGF上游引物为5′GGC AGA AGA AGG AGA CAA TAA ACC3′， 下游引物为5′CAG AGG CAC GCA GGA AGG3′，产物大小361 bp；管家基因βactin上游引物为5′CCA TCT ACG AGG GCT ACG C3′，下游引物为5′CGG CTG TGG TCA CGA AGG3′，产物大小397 bp. （2）标本采集和总RNA提取：各组每只兔按各自观察时间点处死，取出心脏，切取左室前壁缺血心肌迅速置于液氮中保存. 取新鲜组织样品100 mg剪碎，加入1 mL Trizol 裂解细胞，匀浆后进行总RNA的提取. 对所有提取的总RNA进行紫外分光光度定量，测定RNA在分光光度计260 nm和280 nm处的吸收值，计算A260/A280值，均在1.8~2.0之间. （3）逆转录合成cDNA：参照逆转录试剂盒说明书进行. 在20 μL反应体系中分别加入：样本RNA模板0.5 μg，随机六聚体引物(0.2 g/L)1 μL,加入去RNA酶水至12 μL, 70℃孵育5 min；然后加入5反应缓冲液4 μL,RNase 抑制剂（20 u/μL）1 μL,10 mmol/L dNTP 混合液2 μL，25℃孵育5 min；最后加入RevertAidTM MMuLV反转录酶（200 u/μL）1 μL，总体积为20 μL. 混匀后置于下列条件反应：42℃ 60 min，70℃ 10 min，产物即为cDNA. （4）实时荧光定量PCR：反应体系在美国iQ5 RealTime PCR仪上进行,采用25 μL反应体系，其中含SYBR GREEN PCR mix 12.5 μL,去离子水10.5 μL，cDNA 1 μL（50 ng）,引物（5 mmol/L）各1 μL. PCR扩增条件为：95℃ 10 s预变性；95℃ 5 s，57℃ 15 s，72℃ 10 s，共40个循环. 取待测cDNA样品，按10倍浓度梯度稀释，在同样反应条件下进行PCR扩增，制作目的基因和管家基因的标准曲线，检测扩增效率.# l5 F2 {7 z( n/ `
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统计学处理：应用GraphPad Prism 4.0统计软件进行数据分析. 计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及LSDt检验，P﹤0.05具有统计学意义., G. h% \; O! O2 v3 V
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2结果6 E. e2 |( T4 a8 Z, G0 E# f% W0 N
6 F! C j9 `, ~- M0 z1 ^/ P 2.1各组模型兔外周血CD34 细胞百分率的变化冬眠心肌模型兔于术前、术后3,7,28 d各时间点外周血中CD34 细胞百分率分别为2.66±0.34, 5.16±0.61, 8.69±0.34, 2.73±0.57. 术后3 d组和7 d组外周血CD34 细胞百分率高于术前和术后28 d组（P0.05）.% Z$ _6 a* C' p
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2.2各组模型兔冬眠心肌组织中VEGF mRNA表达采用相对定量分析法中比较2-ΔΔCT法，利用公式F=2-ΔΔCT得到VEGF mRNA表达的相对量. 假手术和术后3，7，28 d各组冬眠心肌组织中VEGF mRNA表达相对量分别为1.00±0.05, 1.66±0.17, 2.32±0.31, 1.15±0.07. 术后3 d和7 d组VEGF mRNA表达量显著高于假手术和术后28 d组（P0.05）.) O: u8 l1 w: @) d5 V0 K) G
+ j5 o- i8 {4 D: f) @/ |& E5 D+ d 3讨论
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V$ n0 w# A- b% j$ J* R! q e) c 干细胞定向分化为心肌细胞替代治疗冠心病是近年冠心病研究领域的热点之一. 心脏内有丝分裂的发现，使人们认识到心脏内有可能存在干细胞［3］，新近的研究成果证实了心肌干细胞的存在［4］，众多动物实验验证了干细胞治疗缺血性心脏病的作用［5］. 同时，应用成体多能干细胞治疗缺血性心脏病的临床试验也取得了振奋人心的结果［6］.' h; R$ `1 e0 n" U! C
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急性心肌梗死后，骨髓干细胞在心肌修复过程中涉及两个环节. 首先是骨髓干细胞动员、增殖进入外周血，其次是骨髓干细胞向损伤部位的归巢. 冬眠心肌是由于长期冠状动脉供血减少产生的可逆性功能障碍状态，表现为局部心肌收缩功能持续低下，其心肌血流量的减少与心肌收缩力的下降维持平衡状态. 冠脉血流量一旦恢复，该心肌功能即可部分或完全恢复，它是心肌功能为适应降低的血流量而发生的匹配性下降，是生存心肌在低灌注下防止自身坏死的自我保护. PTCA和CABG是目前治疗冬眠心肌的有效方法［7］. 目前关于干细胞与缺血性心脏病的研究主要集中在心肌梗死，即冠心病的严重类型. 我们提出在心肌处于冬眠状态即未发生心肌梗死时，机体是否也存在干细胞动员和归巢，发挥内源性自我保护机制？0 U& V; x6 Y' R3 Q' M3 e' ~
. O' s! B# A) [ 细胞因子在细胞移植治疗缺血性心脏病中的作用机制有：（1）在心脏损伤处作为趋化因子［8］；（2）诱导移植细胞分化；（3）促进血管生成［9］. VEGF作为细胞因子可促进内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，在生理和病理状态下对于血管新生起着重要作用. 有研究证实［10］，心肌梗死后局部微环境中VEGF表达增加，将VEGF转染的骨髓间充质干细胞移植后，坏死心肌周围的VEGF表达上调，同时观察到梗死区血管密度明显增加.
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本研究结果证实，兔冬眠心肌模型于术后可发生骨髓干细胞动员至外周血，且7 d达到动员高峰；同时观察到术后冬眠心肌组织中VEGF基因表达升高，且于7 d达高峰. 从中可发现心肌缺血早期随着缺血心肌局部VEGF表达升高，外周血骨髓干细胞数量在增加；随着心肌缺血时间的延长，心肌局部VEGF表达下降，外周血骨髓干细胞数量减少.
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因此，冬眠心肌早期也存在干细胞动员的自我保护机制，并且与心肌缺血局部微环境的改变有关.
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