大鼠骨髓间质干细胞和新鲜骨髓细胞静脉移植治疗脑梗死的疗效 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:35 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：王伟, 张志坚吴秀丽, 林建华作者单位：福建医科大学神经生物学中心, 福州  350004
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      【摘要】  目的  比较大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)和新鲜骨髓细胞(fBMC)静脉移植后在脑梗死时脑内存活、迁移及分化情况,及对神经功能恢复的影响。  方法  制备大鼠脑梗死模型,经尾静脉将标记的rMSC和fBMC植入体内,于不同时程对神经功能状况进行评分。应用荧光激发及免疫组织化学方法检测移植细胞在脑内存活、迁移及分化情况。细胞化学染色观察rMSC体外分化情况。  结果  与对照组比较,两移植组神经功能改善明显(P0.05)。两移植组在荧光激发下均可见移植细胞在梗死区及其周边区聚集并存活,且有部分植入细胞分化表达神经细胞表面标志物,在体外rMSC未见类似分化表达。两组植入细胞存活与分化标志表达率差别无统计学意义。  结论  rMSC和fBMC经静脉移植后在宿主脑内均能够存活、迁移并分化表达神经细胞表型,均有促进脑梗死后神经功能恢复的作用。
      【关键词】间质干细胞移植; 骨髓细胞; 脑梗死; 疾病模型,动物

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ABSTRACT:ObjectiveTo investigate that rat mesenchymal stem cells(rMSC) and fresh bone marrow cells(fBMC) infused intravenously for migrate to infarct focus, survive, differentiate into nerve cells, and improve neurological function after cerebral ischemia in adult rats.MethodsrMSC were cultured in vitro.Adult male SD rats were subjected to transient(2 hours) middle cerebral artery occlusion(MCAO).rMSC or fBMC or PBS were infused via tail vein at 24 hour after MCAO respectively.Functional measurements using the modified neurological severity scores(mNSS) were performed at 24 hour, 1 week and 2 weeks after MCAO respectively.Immunohistochemical staining and laser scanning microscopy were used to identify rMSC and cells derived from bone marrow in the brain sections.The specific marking protein of neurons and glial cell were dectected by immunocytochemistry in vitro.ResultsrMSC proliferated rapidly in vitro.There was significant neurological function improvement in rats treated with rMSC and fBMC compared with that of control group, as evidenced by mNSS scores(P

KEY WORDS:mesenchymal stem cell transplantation; bone marrow cells; brain infarction; disease models,animal

近年国内外较多研究已经发现骨髓间质干细胞(MSC)在体内外条件的诱导下可以分化为神经细胞,对神经损伤后功能恢复有一定治疗作用［1-3］。笔者前期工作证实MSC移植对大鼠脑梗死后神经功能恢复有作用［4］。有研究表明,新鲜骨髓细胞(fBMC)移植入鼠体内可分化出神经细胞标志物,神经功能也得到一定恢复［5-7］。若静脉移植MSC和fBMC具有同样的治疗作用,则无疑直接移植fBMC更方便,更有实用价值。因此,笔者将相同数量的大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)与fBMC经静脉移植到大脑中动脉栓塞(MCAO)的大鼠体内,观察两类细胞在大脑缺血灶微环境中存活迁移及分化情况,并比较两者在改善大鼠中风后神经功能损害方面的作用效果。$ K8 C0 l. ^  g- k) V1 K7 I

1材料与方法- n8 q$ a0 K9 @' J1 c# r

1.1材料/ o. Y  _( X, q" C8 z# _/ I% t

1.1.1动物清洁级雄性SD大鼠由福建医科大学实验动物中心提供［实验动物质量许可证号:SGXK(闽)2004-0002;使用许可证号:SYXK(闽)2004-0007］,2～3月龄,体质量280～320 g。3 c6 P7 J; J- u+ x4 G
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1.1.2试剂α-MEM培养液(美国Gibco公司);胎牛血清(FBS,美国Hyclone公司);Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(美国Pharmacia公司);0.25%胰蛋白酶(Trypsin 1∶250,美国Amersco公司);荧光染料(cell tracker orange,CTO,美国Invitrogen公司);小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)多克隆抗体、小鼠抗大鼠神经丝蛋白(NF-200)多克隆抗体及兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体、SABC-FITC免疫组织化学试剂盒(武汉Boster公司)，PV-6001/2试剂盒(北京中山试剂公司)。

1.2方法' k, r  o& f& ~$ Q. h2 K

1.2.1rMSC和fBMC制备取2月龄大鼠双侧股骨和胫骨的骨髓,分离单核细胞体外培养,消化传代。取第2代rMSC长满瓶底时加入1 μmol/L CTO标记液,于荧光激发下观察细胞标记率,消化洗涤后用PBS配成浓度为1106mL-1细胞悬液,准备移植。将新鲜骨髓细胞液直接离心,取离心后细胞加入上述CTO标记液进行标记,观察细胞标记率并洗涤后制成单细胞悬液,调整单核细胞数浓度为1106 mL-1,准备移植。部分第2代rMSC体外继续培养2周并细胞爬片,准备行细胞化学染色。# [8 m/ S0 O( V" T
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1.2.2MCAO模型制备与分组参照文献［8］线栓法,栓塞后2 h再灌注,制备模型鼠48只,随机分为6组,每组8只,分别于再灌注后24 h经尾静脉移植:rMSC悬液1 mL,作为rMSC组(分为移植后1周、2周组);fBMC悬液1 mL,作为fBMC组(分为移植后1周、2周组);PBS 1 mL,作为对照组(分为注射后1周、2周组)。各组于术后24 h、移植后1周、2周按mNSS评分法进行神经功能评分,评分者不知晓分组情况。

1.2.3免疫化学染色及荧光观察移植后1周、2周取脑组织包埋后作5 μm连续切片,每隔5片取1片直接于荧光激发下观察标记细胞在脑内的分布,其余切片进行免疫组织化学染色。切片于阻断封闭后分别加抗Nestin、NF-200及GFAP一抗4 ℃孵育过夜,加生物素化二抗,最后滴加SABC-FITC,封固后分别于不同波长的荧光激发下观察CTO及FITC阳性细胞在脑内的分布。移植后2周组于相同的部位每间隔5张取1张切片,连取5张,分别计数在梗死区及其周边区域CTO阳性细胞数,以及阳性细胞中Nestin、NF-200、GFAP阳性细胞率。同时将体外继续培养的rMSC爬片固定后按PV-6001/2试剂盒方法分别加入上述各抗体4 ℃孵育过夜,最后行DAB染色及苏木精对比染色,在显微镜下观察rMSC体外分化表达的情况。

1.3统计学处理采用SPSS 11.0统计软件对不同时间点的各组mNSS评分行多样本均数比较的方差分析;并对移植后2周组的5张切片上神经标志阳性表达率进行两样本均数比较的t检验。取α=0.05。* p) O% l$ ?% V! g
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2结果

2.1rMSC培养从骨髓中分离的单核细胞接种24 h后大部分贴壁。细胞形态不一,伸出多个突起,成梭形或多角形改变,约12～14 d融合成单层,呈均匀一致的纺锤形。rMSC体外扩增5代细胞数可达21011个。0 i* N1 z2 {* K2 ?. C& Y
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2.2行为学评分MCAO后24 h各组mNSS评分差别无统计学意义(P>0.05)。移植后1～2周每组运动和平衡功能均有不同程度恢复,移植组在第1周时功能恢复明显,到第2周后仍有不同程度恢复,对照组2周内恢复较慢。两移植组在1周、2周时评分均低于对照组(P0.05,表1)。表1对照组、rMSC及fBMC组各时间点mNSS评分) \$ D4 ]: h( }! t2 \' N1 g

2.3免疫化学染色及荧光观察两移植组细胞标记率达95%左右。移植后1周脑切片直接于545～580 nm波长光激发下观察,对照组未见发出红色荧光的细胞,在两移植组均可见CTO标记的细胞发出红色荧光,分布于大脑皮质、皮质下、海马、纹状体,但主要在缺血区,梗死灶侧明显多于对照侧。到第2周时标记细胞存活数有所下降,但更为集中地分布在缺血梗死区,其他区罕见。免疫组织化学染色见一些CTO标记的rMSC和fBMC除发出红色荧光外,在另一波长光激发下还发出绿色荧光,分别表示部分移植细胞能够分化表达神经细胞Nestin、NF-200及GFAP等标志物(图1),同时体外细胞化学染色发现rMSC在体外培养2周后未见表达神经细胞标志物。移植后2周在相同的部位各计数5张切片上梗死灶及其周边区域CTO阳性细胞数,以及这些阳性细胞中Nestin、NF-200、GFAP阳性细胞率(表2),两移植组CTO阳性细胞分化标志物阳性率差别无统计学意义(P>0.05)。表2rMSC和fBMC组2周后脑梗死区CTO阳性细胞分化神经标志物阳性率
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3讨论: H6 S, I) J5 }5 d6 w
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长期认为中枢神经损伤后引起神经细胞不可逆的死亡,从而丧失了神经功能。近年研究发现MSC或骨髓干细胞移植入脑后可分化表达神经细胞标志物,较少发生免疫排斥,对脑损伤后的功能恢复有一定的作用,且骨髓干细胞的应用较少受伦理的制约,这就为脑损伤的细胞移植治疗带来了新的途径。2 N! e9 d+ Y' _. T8 w+ n

3.1造血干细胞(HSC)具有类似MSC的神经细胞分化潜能及治疗作用MSC具有强大增殖能力且易于从骨髓中获取,体外分离扩增MSC的方法较成熟,因此易获得大量的细胞,为移植治疗提供丰富的细胞来源。由于MSC无特异性的表面标志,本研究的前期实验中rMSC表面标志的鉴定显示CD34、CD45表达率接近零,表明rMSC是非造血类干细胞［9］。Li等将一定数量MSC注射到小鼠脑缺血侧纹状体,观察到大量MSC在损伤局部聚3 }- ~7 _5 Y1 {  M& T% l0 F% Q

A～C::rMSC组; D～F: fBMC组.A,D:Nestin; B,E:NF-200; C,F:GFAP. rMSC:骨髓间质干细胞; fBMC:新鲜骨髓细胞.上排：移植细胞，下排：对应上排细胞分化表达神经细胞标志.' d0 B1 _* L% k" J" h- }3 V/ M

图1各组移植后2周脑梗死区部分CTO标记细胞分化表达神经细胞标志(200)- E) U1 `5 [. L" \* v5 Y) j6 U
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Fig 1Some CTO-labeled cellsin cerebral ischemic focus expressed neuronal phenotype after 2 weeks transplantation

集,部分移植细胞分别表达GFAP和神经元特异性核蛋白(NeuN),并且移植组的功能恢复明显好于对照组［1］。Chen等经静脉将MSC移植到MCAO后的鼠体内,得出类似结果［2］。本研究结果与前人相一致,荧光双标显示CTO阳性细胞在脑内主要存活、迁移,聚集在损伤区,且分化表达Nestin、NF-200及GFAP,而体外细胞化学染色并未发现培养的rMSC能表达神经细胞标志物,表明rMSC经静脉移植到体内后,能定向迁移到缺血损伤区,并在局部微环境的作用下分化表达神经元和神经胶质细胞标志物。Hess等将雄鼠fBMC用绿色荧光蛋白标记,经静脉移植到MCAO的雌鼠体内,在7～14 d后观察到在缺血区骨髓来源细胞参与构成血管并表达内皮细胞的表型,也表达NeuN。本实验将fBMC直接移植入MCAO的鼠体内也得出相似结果［5］。有趣的是,CTO标记的fBMC与rMSC之间,分化表达Nestin、NF-200、GFAP的阳性细胞率差别无统计学意义,间接表明HSC在体内也分化表达神经细胞标志物。因为在新鲜骨髓细胞中rMSC只占极小的比例,约十万分之一,主要是HSC,因此从移植后的存活细胞数量上来看,在这两类细胞中存在共同亚群的可能性很小,强烈提示HSC也具有与rMSC类似的分化功能。比较rMSC与fBMC在脑梗死时的治疗作用,两移植组神经功能改善均较对照组明显,但两移植组间mNSS评分差别无统计学意义,也提示HSC在治疗作用上也不比rMSC逊色。5 k5 {& E8 ?& x4 G7 Q. y7 }0 r
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3.2HSC向各种类型组织细胞分化国外已有报道,将纯化的正常小鼠骨髓HSC移植入先天性肝酶代谢异常小鼠体内,能在周围血、脾、骨髓和肝脏内获得不断增殖并纠正肝酶代谢异常,在肝内检测到供体细胞分化而来的具有白蛋白分泌功能的肝细胞,证明此类肝细胞仅来源于供体骨髓中的HSC［10］;将纯化的小鼠骨髓HSC定点移植到小鼠心肌梗死灶的边缘区,所移植的HSC不仅能分化为成熟的心肌细胞,还能分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞,从而在心肌梗死区边缘形成新生的心肌组织［11］。上述实验证实,HSC具有多向分化潜能,但对其机制目前还不十分清楚,大多数作者均同意这种潜能要在一定的微环境支持下才能显现的观点。/ B0 i. z4 H6 K+ V% y: k$ K

3.3MSC和fBMC静脉移植后的治疗机制对这种治疗机制尚未完全明了。首先细胞迁移、聚集到缺血区域可能是脑组织损伤后释放一些细胞黏附分子、炎症因子、趋化因子,对骨髓干细胞的迁移产生一定的趋化性［12-13］;同时脑梗死后血脑屏障的破坏,有助于静脉移植入的骨髓干细胞优先进入缺血脑区。其次细胞移植修复机制可能为:(1)移植细胞向病变部位组织渗透,融合,而替代或补充损伤的神经细胞,与宿主神经细胞形成突触联系,重建神经环路,并可能释放神经递质,达到恢复神经功能的作用［14］。(2)移植细胞在损伤脑组织区与宿主细胞相互作用而分泌一些细胞因子和营养因子,如白介素类,巨噬细胞集落刺激因子,FLT-3配体和干细胞因子等及各种生长因子,如脑源性神经生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等［15-18］。这些因子减少了损伤区神经元的凋亡,促进局部微血管再生,促进神经元的活化及轴突的再生,从而促进了脑组织结构和功能的恢复。在没有直接证据说明骨髓干细胞不仅能分化成神经细胞,而且还能发挥正常神经细胞功能之前,上述各种机制均存在或大或小的可能性。

本研究提示,HSC与MSC在体内具有分化为神经细胞的相似潜能,对脑梗死具有相似的治疗效果。从临床实践来说,获取一定量骨髓HSC无疑比MSC容易得多,这为细胞移植治疗缺血性脑损伤选择合适的移植供体奠定了重要的实验基础——提示存在患者可以应用自身骨髓治疗脑梗死的可能。但目前尚局限于实验动物研究,在临床应用之前,仍需在许多理论和技术上的问题进行深入的探讨。
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