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sunsong7

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发表于 2010-12-6 12:28 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

脐带间充质干细胞移植治疗严重难治性系统性红斑狼疮

Lingyun Sun1, Dandan Wang1, Jun Liang1, Huayong Zhang1, Xuebing Feng1, Hong Wang1,Bingzhu Hua1, Bujun Liu1, Shengqin Ye2, Xiang Hu2, Wenrong Xu3, Xiaofeng Zeng4, Yayi Hou5 , Gary S Gilkeson6, Richard M Silver6, Liwei Lu7, Songtao Shi8

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摘要
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目的：脐带来源间充质干细胞（UC-MSC）基于其自我更新和多向分化能力，在很多动物模型中表现出显著的治疗效果。UC-MSC在人类自身免疫性疾病方面的疗效数据缺乏。这项研究旨在检验异基因UC-MSCT治疗重症难治性系统性红斑狼疮（SLE）病人的安全性和有效性。

方法：该无对照临床研究包括16名SLE病人，标准疗法治疗无效或者是出现危及生病的胃肠道并发症。所有病人均做到知情同意后方进行UC-MSC输注。移植前后病人临床改变的检测项目包括，SLE疾病活动度评分（SLEDAI）、血清抗核抗体（ANA）、抗双链DNA抗体（anti-ds DNA）、血清补体C3和C4、白蛋白和肾脏功能检测。MSCT疗效的机制关注于外周血调节性T细胞的比例和血清细胞因子水平。- p$ S1 A0 u( Q& k# l) J" M7 b# d
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结果：从2007年4月到2009年7月，共有16名活动性SLE患者进入研究，并接受了UC-MSC移植。移植后平均随访时间为15个月（3-28个月）。研究结果显示，SLEDAI评分、血清中ANA水平、anti-ds DNA抗体、血清白蛋白、补体C3和肾脏功能均有显著改善。伴随临床症状缓解，我们观察到外周调节性T细胞的增加以及Th1和Th2相关细胞因子间平衡的重建。所有患者的疾病活动性均显著降低，目前未观察到复发或治疗相关的死亡情况出现。% O; N7 E- X) F7 H" R

结论：UC-MSC移植可以降低疾病活动性，改善血清学指标并稳定促炎性细胞因子。这些数据为组织该疗法治疗严重难治性SLE的随机对照试验打下了坚实的基础。' b- @! x. N3 X/ u
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前言+ b$ u- z7 w1 u( C

系统性红斑狼疮（SLE）是一种多症状的免疫性疾病，可以从较轻的皮肤关节症状到严重威胁生命的主要器官病变，如肾炎和神经精神并发症[1]。该病的特征为自身反应性T淋巴细胞和B淋巴细胞，多克隆活性B细胞，以及随之产生的由浆细胞分泌的自身抗体和细胞因子的释放[2]。SLE最重要的临床症状是狼疮性肾炎，超过50%的患者罹患，并且是发病率和死亡率的一个重要影响因素[3]。传统的免疫抑制或是免疫调节疗法，如糖皮质激素、环磷酰胺（CYC）和麦考酚酸莫酯（MMF），可以控制大多数患有狼疮性肾炎的SLE患者的症状，但并不是对全部患者均有效。有一部分狼疮性肾炎患者，对持续的化疗不敏感，或是治疗后复发，预后普遍较差。再者，大剂量的免疫抑制疗法可能会导致患者出现严重感染，药物毒性的聚积，以及罹患心血管疾病和恶性疾病的机率增加[4]。近10年来，据报道造血干细胞移植是一个新疗法，可以使红斑的病情在不实施其他疗法的情况下得到长期缓解[5]，但复发率以及抑制相关的并发症发生率很高，往往会造成继发性的自身免疫病[6]。因此，需要找到比目前标准疗法疗效增强且毒性更小的新疗法。间充质干细胞（MSC）具有多项分化潜能，能够向骨、脂肪和关节软骨分化，作为细胞的替代来源而被广泛研究和关注[7]。最近的研究显示，MSC可以向内胚层和神经胚层进行分化，包括神经元、肝脏细胞和心脏细胞[8-10]。MSC能够用于自身免疫性疾病的一个重要机制是，MSC作用于多种活性淋巴细胞的免疫调节作用，比如T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞[11-13]。MSC表达很少的人白细胞抗原（HLA）主要组织相容性复合物I类分子（MHC-I），并且不表达MHC-II共刺激分子，如CD80,CD86和CD40[14]。MSC不依赖抗原，以剂量依赖方式直接抑制激活的T细胞增殖。这些特征使得MSC应用于自身免疫性疾病成为可能。
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尽管MSC最初是由骨髓中分离获得的，从其他组织中也可分离获得，如脂肪组织[15]、胎盘[16]、羊水[17]、和胎肺和胎儿血液等胎儿组织[18]。另外，脐带也是MSC的丰富来源[19]。流式细胞分析显示，UC-MSC细胞表面表达CD29、CD44、CD95和CD105，而不表达造血系标记物如CD34、CD38、CD71和HLA-DR[20]。UC来源有核细胞中，成纤维细胞集落生成单位频率也比骨髓来源的有核细胞高。UC-MSC具有高度增殖能力，并只表达低水平CD106[21]，表明UC-MSC可能成为临床应用MSC新的替代来源。

近期，我们实验小组证明来自于SLE病人自体的BM-MSC功能上出现异常，细胞骨架发生改变，自溶体和凋亡小体增加（未发表数据）。同时，正常骨髓及脐带来源的MSC被证明可以显著改善MRL/lpr缺陷小鼠的狼疮性肾炎病理学异常和血清学改变[22]。进一步的研究发现BM-MSC对于难治性SLE患者具有非常显著的治疗效果[23]。因此，本研究中，我们旨在验证UC-MSC在严重难治性SLE患者中的治疗效果。& ^$ p/ C9 T4 a" @) [% D

方法4 r6 X' ?" t' a$ b; q# U  S

患者选择
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从2007年4月至2009年7月，共有16名SLE患者入选MSCT临床研究，年龄范围从17岁到56岁。根据美国风湿病学会的11条标准[24]，所有入选的患者均至少具备其中的4条。入选标准包括：（1）+（2）+（3）或（4）或（5）：（1）疾病处于进展期和活动期，SLE病情活动评分（SLEDAI）≥8；（2）不少于六个月对每月环磷酰胺(CYC；500～1000mg/m2)静脉冲击疗法无效，或者至少三个月对口服麦考酚酸莫酯（MMF；2000mg/d）治疗无反应；（3）连续每日使用强的松超过20mg，或与之相等的剂量；（4）难治性免疫介导的输注依赖性的血小板减少症；（5）难治性狼疮肾炎。难治性狼疮肾炎被定义为24小时蛋白尿≥1000mg，或者血清肌酐≥1.5mg/dl，或者患有世卫组织分级为IV/V肾小球肾炎的病人在经过6个月的CYC治疗或者是3个月的MMF治疗后未出现终末期肾病，但肌酐清除率下降。如果病人出现无法控制的感染，平均动脉压﹥50mmHg，一个关键器官衰竭，处于妊娠期或哺乳期，则被排除。本临床研究遵守目前的最佳临床实践标准（Current Good Clinical Practice Standards）和1989年赫尔辛基宣言中指定的伦理准则。试验方法经过南京大学医学院鼓楼医院伦理委员会审查，每位患者做到知情同意。" V0 o- K* J2 Q$ z
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UC-MSC纯化与鉴定$ f2 g2 Y; J3 D( M

UC-MSC由江苏省干细胞中心（北科生物）制备。新鲜的脐带取自当地医院顺产的健康产妇（已获知情同意），并尽快进行处理。脐带先用加入盘尼西林和链霉素的磷酸缓冲盐水冲洗两次，以去除脐带上残留的血液。然后将脐带减切成大约 1mm2大小的小块，并放置于含有10�S的低糖DMEM培养基中。脐带组织块进行常规培养，37℃，湿润空气，5%CO2。非贴壁细胞冲洗掉。原代培养时，培养基每3天进行一次更换，当细胞在10天呈现成纤维细胞样形态时，细胞经胰蛋白酶消化后，传代到新的培养瓶中进行下一步的扩增。
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所有输注的UC-MSC均来自于第二代到第五代细胞，并经过严格的纯化及指控过程。纯化的MSC细胞活力>92%（Trypan Blue检测），每份细胞均为抗原微生物阴性，包括需氧菌和厌氧菌（直接培养分析），HBsAg、HBcAb、HCVAb、HIVAb-I、HIVAb-II、CMV-IgM和梅毒抗体（运用酶联免疫吸收法）均为阴性。流式细胞分析显示，CD29、CD73、CD90和CD105表达率>95%，同时，CD45、CD34、CD14、CD79和HLA-DR表达率<2%。每份细胞的上清丙氨酸转氨酶（全自动生化分析仪）和内毒素（鲎试剂分析）分别严格控制在40IU/L和5EU之内。MSC的成脂和成骨能力也被检测。$ k) ^' t' R6 e7 t) u" `$ W2 z

UC-MSCT 步骤' @* I8 R* r9 R! d

在进行MSCT之前，有11位患者经静脉给CYC，从0.8g到1.8g，连续服用两天。另外的5位患者因为在移植前病情较重或者出现骨髓抑制而没有使用CYC。按每公斤体重1×106个细胞进行静脉输注MSC，在输注前未给予如激素、抗组胺药物等。

UC-MSCT后的第一个月内，强的松的剂量每两周减少5-10mg。所有的患者每天服用5-10mg强的松，有13位患者再添加CYC0.6-0.8g每2-3个月作为维持治疗。除复发外，没有使用其他任何的免疫抑制剂。如果患者病情持续改善，则逐渐减少强的松和CYC的使用，一直到停止使用药物。如果病情复发，患者则改用其他方法或者进行第二阶段的MSCT。

随访步骤
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所有的16名患者均成功完成治疗，并分别在1个月、3个月、6个月、12个月和18个月时进行随访。随访时进行的检测包括常规体检、SLEDAI评分、血清学分析以及治疗前不正常器官的功能检测。如果患者无法回到医院进行复查，病史及实验室检查则在当地的医院进行采集。研究者在研究过程中对副反应及其严重程度进行监督和记录。
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实验室检查

取2ML外周血经肝素抗凝后，运用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离得到单个核细胞，即PBMC。Anti-CD4-FITC,anti-Foxp3-PE和抗鼠-IgG2a-PE等抗体购自美国eBioscience。外周血中CD4+Foxp3+调节性T细胞（Tregs）的比例用流式细胞仪进行分析，所得数据通过CellQuest软件（Becton Dikinson）进行分析。至少收集到5.0×105个T细胞。抗核抗体（ANA）和抗双联DNA抗体（Anti-dsDNA）用酶联免疫吸附法（ELISA，OUMENG，德国）进行检测。ANA值用标本血清与对照组的OD值进行计算。Th1、Th2和Tregs相关细胞因子（IFN-γ,IL-4,TGF-β,IL-10）的浓度用ELISA法测定（R&D,美国）。

统计学分析) N6 h2 y7 F& k8 e% p& f1 B/ w
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每位患者移植前后的数据及免疫学指标运用配对t检验进行比较分析，软件为GraphPad Prism 4 （4.03版本），所有的P值均为双侧，p<0.05则认为具有统计学意义。

实验结果：

研究样本摘要

16例严重、难治性SLE（系统性红斑狼疮）患者（14女；2男；年龄17-55岁，平均年龄为31.8+11.3岁）入组并接受UC-MSCT治疗，平均患病时间为65.1+53.9个月（2-168个月）；平均随访期为15个月（3-28月）。10例患者完成了6个月的随访，2例患者随访了2年多。表1中为入组患者的相关信息及临床症状；表2为每个患者接受MSCT前、后的详细治疗方案。
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疾病评价

16例入组患者在经过UC-MSCT治疗1个月后，其SLEDAI评分均显著性下降（10.8+0.8，基线值为18.4+1.1，n=16， p<0.001），治疗3个月后获得进一步改善（7.9±0.8, n=16,  p<0.001，与治疗前相比）。10例随访至少6个月的患者，SLEDAI评分逐渐下降（7.3±0.7 vs 19.0±1.6, n=10, p<0.001）；2例（患者1和2）随访2年的患者的SLEDAI评分维持在<4的水平（图1）。9 Z' h, Z+ y6 t; U) x% _

肾功能评价

分别监测了患者的24小时蛋白尿、血清肌酐及尿素氮。3个月随访时，15例患者的蛋白尿获得改善（1338.0±910.3 mg，治疗前为3121.5±1191.4 mg, n=15,  p<0.001）；6个随访时，8例患者的蛋白尿获得进一步改善（治疗后6个月为1056.5±866.5 mg，而治疗前为3237.4±1259.9 mg, n=8, p=0.001, 图2A）。2例随访2年的患者的蛋白尿分别保持阴性1年和18个月（至少重复检查2次）。其中6例血清肌酐升高（3.99±2.19mg/dL）的患者经过治疗获得较好的改善，3个月随访时降至2.25±1.06mg/dL（n=6,  p=0.035 vs MSCT治疗前）；6个月时降至1.82±0.88mg/dL（ n=3, p=0.026 vs MSCT治疗前）。其中2号患者的血清肌酐在1年随访期时降至正常，并且没有回升。同时我们发现，入组时血清肌酐升高的患者尿素氮水平亦下降了（图2B）.
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血清学检查/ F5 w# h7 J, |; L' G$ F! G

13例血液蛋白不足的患者（23.56±1.53g/L），经过治疗，3个月随访时白蛋白逐渐上升（31.63±0.96g/L, n=13,  p<0.001 vs MSCT治疗前），7例患者6个月随访时几乎达到正常值（34.63±1.75g/L, n=7, p<0.001 vs MSCT治疗前, Fig 3）。13例患有蛋白缺失性肠病的患者经过MSCT治疗后，在3个月随访时白蛋白水平由治疗前的18.1g/L回升至36.5g/L，并且这些患者伴随的腹泻症状明显好转。5例患者的血清补体C3水平在治疗3个月后由0.44±0.05g/L 升高至 0.69±0.04g/L （n=5,  p=0.05）。1号患者和2号患者的补体C3水平12个月随访时分别达至1.05g/L 和0.97g/L，并且疗效维持没有反复。13例患者的Anti-dsDNA抗体水平在治疗3个月后显著性下降（316.6±423.7IU/ml  vs 414.4±401.2IU/ml, n=13, p=0.03），其中3例患者在治疗6个月后仍持续下降（720.5±741.4IU/ml vs 810.2±722.9IU/ml, n=3, p=0.03），6个月随访时，7号、9号及11号患者均已检测不到Anti-dsDNA抗体了。虽然治疗3个月后患者的血清ANA没有显著性差异，但在6个月时呈现明显下降趋势（4.6±1.4 vs 6.1±1.6, n=3,  p=0.02）。2 f7 u9 g" g% U& v. K* n

全身改善

6例伴有难治性血细胞减少症的患者，治疗1个月后血小板计数由基线值46±32×109/L增加至83±56×109/L（p=0.13），3个月后获得进一步改善（91±7×109/L vs基线水平 49±11×109/L , n=5, p=0.01）。2号和7号患者伴有中枢神经系统症状（癫痫发作），经过治疗后获得改善并未复发。患有严重高血压的患者的血压在行MSCT治疗后，血压水平获得较好的控制，且其伴随的肾功能异常亦获得改善。  h8 b; w( u: e7 `9 j
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UC-MSCT相关的细胞因子与Treg细胞5 V% c* a& K4 Q+ @8 {1 L

为了明确UC-MSCT可能的作用机制，我们比较了MSCT治疗前、后外周血中的CD4+Foxp3+ T cells （Tregs）细胞比例，具有显著性差异。治疗3个月后，患者的Tregs显著性增加（1.34%±0.74% vs 2.03%±0.80%, n=16, p=0.03），6个月上升至2.70%±1.70% （n=5, p=0.04, 图4A）。

新近的一些研究亦发现，β 转化生长因子（TGF-β）和白介素10 （IL-10）与Tregs的增殖与分化相关。我们亦检测评价了这2个细胞因子治疗前、后的变化，我们发现，TGF-β浓度在治疗后3个月时显著上升（3.06±1.60ng/ml vs 1.96±0.98ng/ml, n=13, p=0.003），6个月仍持续增加（2.01±1.59ng/ml vs 0.92±0.43ng/ml, n=3, p=0.07, 图 4B），但IL-10浓度治疗前、后却未发现显著性变化（图 4C）。; j3 `# [) b& n# a- w* q2 q

细胞因子Th1和Th2检测
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早前也有研究表明，SLE患者的Th1/Th2细胞比例失衡，我们据此亦评价了MSCT治疗对这2类T细胞亚群的影响效果。我们发现，白介素4（IL-4）水平在治疗后3个月有较明显的下降趋势（33.11±2.33 pg/ml vs 37.36±2.31pg/ml基线值, n=12, p=0.02），同时γ干扰素（IFN-γ）水平在治疗3个月后呈现上调趋势（38.38±17.84 pg/ml vs 32.05±19.10 pg/ml 基线值），但没有统计学意义。
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副反应. h2 E/ A# m0 d9 ~' H# C
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16例患者中仅有1例在输注CYC时出现严重呕吐，但呈一过性。在进行UC-MSCT治疗期间及治疗后未发生与治疗相关的死亡事件及其他不良反应，所有入组患者耐受良好。8 G7 Z" L" O- [, H" d. Y

讨论( G! ~0 M3 A+ i' ~8 m) z
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间充质干细胞（MSC）为一类非造血系的多能干细胞，在组织再生的临床应用方面具有较好的应用前景。虽然目前MSC的免疫调节作用的可能机制尚未完全揭示，但其具有的低免疫原性，及其对免疫应答良好的调节作用等生物学特性，使得MSC具有良好的临床应用前景，尤其是用于严重、难治性自身免疫性疾病的治疗方面。目前已有一些相关的临床研究在进行中，如MSC用于治疗异基因造血干细胞移植后的急性GVHD[25,26]，MSC治疗自身免疫性疾病如系统性硬化[27]和I型糖尿病[28]。
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老鼠的狼疮模型中，异种的MSCT包括骨髓来源的及脐带来源的MSC均证实有较好的治疗作用[22,23]（未发表数据）。2007年，我们曾用脐带来源的MSC治疗过2例严重感染及难治性SLE患者，治疗3个月后患者获得了令人吃惊的临床效果：2例患者的疲劳症状、蛋白尿、腹水、关节痛均得到缓解，其中1位患者的癫痫发作、鼻衄及进行性高血压亦有明显好转。这2例患者的器官功能也获得了显著性改善，并且逐渐减少了强的松的用量，以致不需要继续使用免疫抑制剂。经长达2年的随访，这2例患者临床疗效一直持续，且未出不良反应。至此，我们就开始了入选更多的严重难治性SLE的患者参与研究。在这个样本稍大的研究中，我们亦发现一些其他症状的改善，如24小时蛋白尿及血清肌酐的下降，同时白蛋白水平、补体C3、血小板计数及血红素水平上升。
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我们对11例患者采取静脉输注环磷酰胺（0.8g -1.8g）进行预处理，以抑制患者的免疫应答。这些经过预处理的患者在接受MSCT前均对环磷酰胺及其他免疫抑制剂不反应。我们研究方案中预处理时环磷酰胺的剂量较自体造血干细胞移植治疗前的使用剂是要低得多[5,29]。预处理过程中未发生严重不良反应，耐受性较好，仅有第2名患者发生一过性呕吐但很快好转。接受预处理的患者未出现严重白细胞减少症或粒细胞缺乏症。其中5例患者由于伴有严重血细胞减少或骨髓抑制，未实施上述预处理。但从临床疗效来看，我们并未发现预处理组和未经预处理组具有显著性的疗效差异，这提示我们，患者的临床疗效是来自于MSC而并不是来自由环磷酰胺的预处理。) F; j: \& ]3 k: r2 O) }
3 S. P; S( o+ X
一过性的改善及疾病的早期反复提示我们，导致狼疮的免疫异常被UC-MSCT抑制，长时间的疾病改善效果及血清学指标改善表明，UC-MSCT可能从根本上改变了患者的免疫系统。为了进一步揭示MSCT的可能作用机制，我们评价对比了MSCT治疗前后的T细胞水平。

调节性T细胞，为一类新的T细胞亚群，由初始的CD4+T细胞分化而来。近十年来许多的研究提示，调节性T细胞通过免疫抑制作用来调节免疫反应[30,31]。当前的研究证实了，在活动性的SLE患者体内的Tregs细胞的频率与功能都呈现不足状态[32]，经皮质类固醇治疗后可恢复，并可缓解疾病[33]。这表明，这类T细胞亚群参与SLE的疾病病理过程。转录因子Foxp3在Tregs细胞发育及产生功能的过程中起着关键分子的作用，通常作为Tregs细胞的核标记[34]。此项研究中，我们观察发现，UC-MSCT治疗3个月后，患者外周血单个核细胞中的CD4+Foxp3+Tregs细胞比例显著上调，治疗6个月后仍继续上调。另外，我们还观察到，在Tregs细胞的激活与产生功能过程发挥重要作用的2个细胞因子TGF-β和IL-10[35,36]，伴随着Tregs细胞的恢复，这2个细胞因子水平亦有所上调。这说明，UC-MSC治疗SLE的临床疗效可能与Tregs细胞的通路增加有关。

IFN-γ 和IL-4 是代表 Th1和Th2 亚群的典型细胞因子。Schwarting 等 [37]发现，在SLE的进程中，IFN-γ具有保护作用。另一方面，在活动性的SLE患者的外周血中IL-4水平升高[38]。这个结果说明，SLE患者中Th1/Th2的平衡主要取决于Th2。治疗3个月后，UC-MSC可以显著性地抑制血清中IL-4的浓度，使SLE患者的体液性免疫得到抑制，于是间接地抑制了自身抗体的产生，尤其是anti-dsDNA抗体——这是与老鼠模型及SLE患者疾病改善最为相关的抗体[39]。另外，已有研究证实，MSC具有抑制B细胞激活及分化为浆细胞的作用[40]，因此，我们推断，对体液免疫的抑制为UC-MSCT发挥临床作用的另一可能机制。另一方面，3个月随访时，伴随anti-dsDNA抗体的轻度改变，2例患者有肾炎的患者（6号和12号患者，补充材料1）的肾功能获得显著性改善。这提示我们，除了抑制浆细胞分泌自身抗体外，UC-MSC的免疫抑制特性亦有预防疾病复发的作用。1号和2号患者的血清C3水平在治疗12个月后仍维持正常水平，及全身体症状缓解，这也表明UC-MSC对SLE的临床效果具有长效性。7 b6 d' j6 [+ o8 A
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综上所述，我们的研究证明，UC-MSC在治疗严重、难治性SLE方面具有意义重大的临床疗效。所有入组的患者在治疗3个月后都获得了临床症状及血清学指标的改善，其中2例患者在没有用免疫抑制剂的情况获得了同样积极的治疗效果。此项研究第一次证明了，至少在短期内UC-MSC在治疗严重、难治性SLE方面具有的安全性与有效性。未来需要更大样本，更长随访期，与标准治疗方案对照的临床研究以进一步证明UC-MSC在SLE方面的安全性与有效性。9 \  R$ z: b. p( J4 u- g7 m
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图表及参考文献请参照原文。9 E( r1 D  {: ~

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文献来源： Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in severe and refractory systemic lupus  p" n8 ?* Z9 ?8 u# E% d9 P# A

                  erythematosus. Arthritis & Rheumatism, DOI 10.1002/art.27548. Received: Nov 21, 2009;

                  Revised: Apr 15, 2010; Accepted: Apr 27, 2010
9 V* d3 R2 ^! p$ {! Z, C

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沙发

发表于 2010-12-6 12:29 |只看该作者

本帖最后由 sunsong7 于 2010-12-6 12:53 编辑 , Q) h- h  L) k& w2 C

老狼点评：) B7 E% z7 N7 E5 E5 K  d
1、伦理学问题：干细胞治疗治疗SLE的临床前安全性数据是否完整？文章中没有提及风险控制预案？受试者年龄在17-55岁之间，对他们来说干细胞治疗是否是最后的必然选择，可能发生的长期后果是否可接受？. W1 m. t* i6 \. a
2、制品质量可控性：文章中没有提及保障干细胞制品一致性和稳定性的指标，安全性指标设置也十分简陋，没有质量保证的制品临床上的有效性和安全性数据没有实际意义；# c, t) K  K# k- o: [0 h* r. Y9 P
3、临床方面：国内文章的通病，临床方案没有设立平行对照组，实验结果能够说明什么问题？7 }+ x' G  ]! M- {
4、制备工艺：文中“将脐带减切成大约1mm2大小的小块，并放置于含有10�S的低糖DMEM培养基中。脐带组织块进行常规培养，37℃，湿润空气，5%CO2。”....如何实现1mm2值得怀疑? 这样过程得到的是干细胞吗？