血管紧张素II对成人脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的影响 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:35 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：张卫泽，樊艳，陈永清，马凌，秦勉，哈小琴，韩娟萍作者单位：兰州军区兰州总医院：心血管内科，医学实验中心，甘肃兰州 730050，兰州大学临床医学院内科学心血管病专业，甘肃兰州 730000


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      【摘要】  目的：观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)向心肌细胞方向分化的诱导作用，并与5氮杂胞苷（5aza）作比较. 方法：自成人脂肪组织中分离培养ADMSCs，分别用AngⅡ（Ⅰ组）和5aza（Ⅱ组）诱导ADMSCs，同时设立对照组（Ⅲ组），光镜下观察细胞的生长情况及形态学变化，电镜下观察细胞的超微结构，免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ），MTT法检测细胞活性，流式细胞术分析细胞周期及凋亡. 结果： Ⅰ,Ⅱ组ADMSCs诱导后呈现类似心肌细胞的形态学特征，第28日Ⅰ, Ⅱ组均表达cTnⅠ，两组间诱导转化率无差别，其中Ⅰ组ADMSCs增殖迅速，较少凋亡细胞. 结论： AngⅡ在促进ADMSCs增殖的同时诱导其向心肌细胞分化，优于传统的化学诱导剂5aza. ; Q- a1 R& p; {2 Y9 v
      【关键词】干细胞；脂肪组织；血管紧张素Ⅱ；5氮杂胞苷；心肌细胞；诱导分化
   　　Effect of Angiotensin Ⅱ on differentiation of adult adiposederived mesenchymal stem cells into myocardial cells7 }9 s! d2 D9 y5 A3 q2 l

　　ZHANG WeiZe, FAN Yan, CHEN YongQing, MA Ling, QIN Mian, HA XiaoQin, HAN JuanPing

　　Department of Cardiology, 3Medical Experimental Center, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China, Angiocardiopathy Specialty, Clinical Medical School, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China% R9 J( A4 A. H9 j( m! c
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　　【Abstract】 AIM: To study the induction effect of angiotensin Ⅱ (AngⅡ) on the differentiation of adult adiposederived mesenchymal stem cells (ADMSCs) into myocardial cells, and to compare its effect with 5azacytidine (5aza). METHODS: ADMSCs were isolated and cultured from adult adipose tissue. AngⅡ (Group Ⅰ) and 5aza (Group Ⅱ) were added to induce ADMSCs, while control group (Group Ⅲ) was set up. Cell growth and morphological changes were observed with light microscope. Electron microscope was used to observe cell ultrastructure, while immunocytochemical methods was adopted to test cardiacspecific troponinⅠ (cTnⅠ). MTT was used to assay cell viability and flow cytometry was to analyze cell cycle and apoptosis. RESULTS: ADMSCs in Group Ⅰ and Group Ⅱ showed similar myocardial cells in morphological features. Twentyeight days after induction, ADMSCs in Group Ⅰ and Group II both expressed cTnⅠ, and induced conversion rate in these 2 groups had no discrimination. ADMSCs in Group Ⅰ had higher proliferation rate and lower apoptosis rate than those of Group Ⅱ. CONCLUSION: AngⅡ can not only promote ADMSCs proliferation but also induce differentiation to the direction of myocardial cells. Its effects is better than that of traditional chemical inducer 5aza.

　　
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　　【Keywords】 stem cells; adipose tissue; angiotensin Ⅱ; 5azacytidine; myocardial cells; induced differentiation7 ], [5 w/ X9 [/ B" {" t
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　　0引言( b: j" s. |3 A3 Z0 x! S
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# ~1 G$ a/ _! h$ m( h8 v
　　近年有实验证明，血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）能够诱导人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）分化为心肌样细胞. 而脂肪间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells，ADMSCs)［1］以其独特的优点在再生医学及组织工程领域有着更为广阔的应用前景. ADMSCs是否也能够被AngⅡ诱导向心肌细胞方向分化，AngⅡ的诱导分化作用与传统的化学诱导剂5氮杂胞苷（5azacytidine，5aza）有何不同？目前有关这方面的研究相对较少. 本实验通过使用AngⅡ作为促分化物质，观察其对ADMSCs向心肌细胞分化的影响，并与5aza比较，以期优化ADMSCs的体外诱导分化条件.5 B1 Y2 ?5 ]8 U. V: a
; l+ B  b5 O- y: }
　　1材料和方法
1 j+ G' j4 C4 q( r1 u
　　1.1材料高糖DMEM培养基，Ⅰ型胶原酶(Gibco)，胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)（杭州四季青），胰蛋白酶（Invitrogen），AngⅡ（AnaSpec），5aza, MTT（Sigma），鼠抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ, cTnⅠ）单克隆抗体（CHEMICON），SP免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒（北京中杉金桥），流式细胞仪（BECTON DICKINSON），酶标仪（芬兰雷勃），倒置相差显微镜及成相系统（Olympus），透射电子显微镜及成像系统（日本JEM1230）. 成人腹部大网膜脂肪组织（自兰州军区兰州总医院普通外科无菌手术条件下获取）.) C2 t% f$ X! T8 G7 J2 i$ q

　　1.2方法

　　1.2.1体外分离培养将脂肪组织清洗、剪碎，加入2倍体积的1 g/L Ⅰ型胶原酶，37℃振荡消化60 min，1500 r/min离心10 min，弃上清，加完全培养液（含100 mL/L FBS, 100双抗的HGDMEM培养基）吹打细胞沉淀，过200目细胞筛，37℃, 50 mL/L CO2, 饱和湿度条件下培养. 48 h后首次换液. 生长至70%～80%融合时，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.* F% y# a+ X# E  Q" R% [
3 z& V% L/ D3 t3 n9 ~3 S
　　1.2.2分组诱导取生长状态良好的第4代ADMSCs，随机分成3组： Ⅰ组加入0.20 μmol/L AngⅡ，Ⅱ组加入10 μmol/L 5aza，孵育24 h，PBS洗3次，换完全培养液. Ⅲ组为对照组，仅常规换液.

　　8 w( v, u) b1 ?% Q8 t# T4 M' s
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　　1.2.3诱导后细胞的鉴定诱导后28 d，消化收集各组细胞，于6孔板内行细胞爬片. PBS洗3次，4℃丙酮固定15 min，PBS洗3次. 按SP免疫组化染色试剂盒说明书步骤行cTnⅠ染色（一抗按1∶100稀释）. 经DAB显色，复染、脱水、透明、封片. 光镜200倍视野下，每张爬片随机取4个视野，计数显黄色的阳性细胞数（N1）和总细胞数（N），按公式（N1/N100%）计算心肌样细胞转化率.' c/ ~4 z5 |9 P& w( a+ Z/ D

　　1.2.4观察超微结构诱导后14 d，消化收集各组细胞，1000 r/min离心10 min，PBS洗1次，30 g/L戊二醛4℃固定72 h，PBS洗3次，常规方法制作电镜标本，透射电子显微镜下观察拍照.$ E& d) l% O/ v& k- U3 f
' h; H, R, Q5 p* H' ?8 X
　　1.2.5MTT法检测细胞活性消化收集第4代ADMSCs，调整细胞密度为2104个/mL，随机分成3组接种于96孔培养板，每组4孔，每孔200 μL. 24 h后Ⅰ组换0.20 μmol/L AngⅡ诱导培养液，Ⅱ组换10 μmol/L 5aza诱导培养液，孵育24 h，换完全培养液，Ⅲ组为对照组，仅常规换液. 上述处理后7 d，各孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，混匀后37℃孵育4 h，加入二甲基亚砜150 μL，温和振荡10 min. 酶标仪上490 nm处读出吸光度（A）值. 上述过程重复3次.

　　1.2.6流式细胞术检测细胞周期及调亡取第4代ADMSCs，分别经0.20 μmol/L AngⅡ, 10 μmol/L 5aza作用24 h后，1000 r/min离心5 min，PBS洗1次，750 mL/L乙醇4℃固定过夜. 1000 r/min离心10 min，PBS洗3次，调整细胞密度为1106个/mL，取100 μL细胞悬液，加入1 mL碘化丙啶，孵育30 min，上机检测. 采用Muticycle软件分析G0/G1, S, G2/M及凋亡细胞的百分含量. 同时设立对照组.
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+ j; h9 @: I! F2 p( ?9 \
　　统计学处理：数据采用SPSS 10.0软件处理，组间比较采用Oneway ANOVA方差分析，P5 ^% B, Q  q0 {1 J& C
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　　2结果4 s9 c" a3 }# `' O, [

　　2.1形态学改变倒置相差显微镜下观察，ADMSCs经AngⅡ或5aza诱导后7 d左右，形态均开始发生改变，逐渐变长、变大，呈短棒状，有分支，类似心肌细胞. 同时也观察到AngⅡ组细胞增殖迅速，有聚集生长的趋势，而5aza组见部分细胞皱缩、脱壁，甚至降解、死亡（图1）. 诱导后14 d透射电镜下观察，ADMSCs拉长呈不规则形，胞核呈长梭形，有沟槽，细胞器增多，其中AngⅡ组细胞的胞质丰富，有大量线粒体、内质网、溶酶体等细胞器，并可见肌丝样结构，细胞状态良好；而5aza组部分细胞的细胞器空化，胞质内可见较多空泡形成，这是细胞受到毒性作用的表现；对照组细胞较幼稚，胞体圆形，表面有较多伪足，核大、圆，核仁大、染色深，有分叶，细胞器较少，未见肌丝样结构（图2）.0 _/ ~( z# u* Q) Z" F; K. R4 B

　　A： AngⅡ组； B： 5aza组.
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　　图1诱导后28 d光镜下的形态特征100（略）
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　　2.2免疫细胞化学染色诱导后28 d，免疫细胞化学染色显示AngⅡ组和5aza组均表达cTnⅠ（图3），对照组未见cTnⅠ表达. 统计学分析转化率，AngⅡ组为(30.73±3.49)%，5aza组为(31.27±3.52)%，二者之间差异无统计学意义（P>0.05）.0 e  @1 }( a0 I, Y6 Y7 ?

　　2.3细胞活性统计学分析A值，AngⅡ组为0.3075±0.04，5aza组为0.0825±0.01，两组与对照组（0.19±0.02）相比，差异均有统计学意义（P
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　　2.4细胞增殖周期及凋亡流式细胞术分析S期，AngⅡ组为42%，明显高于对照组（5.3%），5aza组为2.0%，低于对照组. 同时分析细胞凋亡，5aza组为32.0%，明显高于对照组（1.7%），AngⅡ组为12.6%. 可见AngⅡ具有促进ADMSCs增殖的作用，而5aza则对细胞具有一定的毒性作用，引起细胞凋亡，这与在光镜及电镜下观察的结果一致.% L0 H$ W9 H2 e* k% q- ]- k4 q
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　　A：对照组8000； B：诱导后第14 d6000； C： AngⅡ组15 000； D： 5aza组15 000.
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　　图2ADMSCs的超微结构（略）9 }6 _) S9 x$ I* |) Q% Y
7 ?' B/ e0 r" _" D' q  z
　　A： AngⅡ组； B： 5aza组.

　　图3免疫细胞化学染色显示cTnⅠ阳性表达200（略）6 ?9 r  |  z5 {- ]
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　　3讨论
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　　以往的实验多采用化学诱导剂5aza. 5aza是胞嘧啶核苷的一个类似物，可引起DNA中某些胞嘧啶低甲基化，从而参与激活表型特异性基因，启动干细胞向心肌细胞分化［2］. 同时还观察到，作为化学诱导剂的5aza对细胞有一定的毒性作用［3］. 在本实验中，我们也观察到同样的结果，ADMSCs经5aza作用后，部分细胞皱缩、脱壁、胀大，甚至降解、死亡，电镜下见部分ADMSCs胞质内有大量空泡形成，细胞器空化. 所以，寻求某种安全、有效、经济、可行的诱导剂成为ADMSCs真正走向临床急需解决的问题.: U/ y( l3 r; ~) K' ], A( e+ F

　　在这一方面，国内外学者做了大量工作. 国外Gaustad等［4］、国内李宾公等［5］用鼠心肌细胞提取物成功将人ADMSCs诱导分化为心肌样细胞，并且发现心肌细胞裂解液的这种诱导分化作用具有浓度依赖关系，推测心肌细胞中含有一些具有诱导分化作用的可溶性物质. 但是心肌细胞提取物成分复杂，应用于临床存在许多不确定因素.' P! M+ P) n! F% m7 W( x: X$ H

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　　近年国内苑媛等［6］用AngⅡ将人BMMSCs成功诱导为心肌样细胞，提示AngⅡ可能是心肌细胞提取物的有效成分或其中之一. 在本实验中，我们使用AngⅡ作为促分化物质，证实ADMSCs经AngⅡ作用后能够表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ），并具有肌细胞的超微结构，说明AngⅡ可以诱导ADMSCs分化为心肌样细胞，其诱导转化效能与5aza无差别. 同时还观察到AngⅡ作用于ADMSCs后，细胞增殖迅速、有聚集生长的趋势，流式细胞术也证实S期细胞较多，凋亡细胞较少，而5aza作用后恰恰相反. 说明AngⅡ对细胞无毒性，且可促进ADMSCs的增殖.

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　　AngⅡ的诱导分化机制尚不十分清楚. 有研究显示，AngⅡ可以引起MAPK酪氨酸磷酸化而活化ERK［7］，能促进TGF β1基因，TGF β受体基因表达［8］，进而又激活包括MAPK, PKA, PKC等在内的多条信号转导通路［9］，导致多种细胞活化［10］. 推测AngⅡ的这种诱导分化机制可能与活化这类细胞信号转导通路有关. 在今后的实验中，我们将就诱导分化机制方面作进一步的研究. 总之，细胞因子AngⅡ，能够在促进ADMSCs增殖的同时诱导其向心肌细胞分化，是一种更具临床应用前景的生物活性诱导剂.
      【参考文献】( \' f' e+ |! T5 p& q
　　［1］ Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies ［J］. Tissue Eng, 2001, 7(2):211-228.8 Q! `7 L" o6 S2 t

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　　［2］ Fukuda K. Development of regenerative cardiomyocytes from msenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering ［J］. Artif Organs, 2001,25(3):187-193.5 l. g$ i0 W9 q  V2 Y
: g3 D+ }8 K8 [+ A/ {
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　　［3］袁  岩, 陈连凤, 张抒扬, 等. 心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究［J］. 中华心血管病杂志, 2005,2:170-173./ X% e8 U& E- P/ o. T
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% j5 V: |# m) W" K8 U" j# Q) `* E
　　［4］ Gaustad KG, Boquest AC, Anderson BE, et al. Differentiation of human adipose tissue stem cells using extracts of rat cardiomyocytes［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2004,314(2):420-427.+ Z, `: R9 o+ I/ G  S6 {

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　　［5］李宾公, 曾秋棠, 王红祥, 等. 心肌细胞裂解液诱导人脂肪基质干细胞分化为心肌样细胞的研究［J］. 中国急救医学, 2006,26(4):280-282.

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4 _! {) H8 {, |+ p
　　［6］苑  媛, 吕安林, 陈  丹, 等. 血管紧张素Ⅱ诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞［J］. 心脏杂志, 2006,18(3):258-261.! U+ X- J3 n; C2 N, b1 q

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　　［7］ Payne DM, Rossomando AJ, Martino P, et al. Identification of the regulatory phosphorylation sites in pp42/mitogenactivated protein kinase (MAP kinase) ［J］. EMBOJ, 1991,10(4):885-892.
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5 Z2 \  _2 ?6 k7 d. R" V2 h! h9 r  F
/ S5 F+ u, v4 E" v' Z# i! v
　　［8］ Schultz Jel J, Witt SA, Glascock BJ, et al. TGFbeta1 mediates the hypertrophic cardiomyocyte growth induced by angiotensin Ⅱ［J］. J Clin Invest, 2002,109(6):787-796.+ l- h6 R, a( a  ?% \0 r

　　［9］ Li TF, OKeefe RJ, Chen D. TGFbeta signaling in chondrocytes［J］. Front Biosci, 2005,10:681-688.
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　　［10］ Giasson E, Meloche S. Role of p70 S6 protein kinase in angiotensⅡinduced protein synthesis in vascular smooth muscle cells［J］. J Biol Chem, 1995,270(10):5225-5231.

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