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发表于 2009-3-3 12:35 |显示全部帖子 |倒序浏览 |打印

作者：陈凯佳，  刘小斌，  邱仕君，  周健洪，  肖  莹作者单位：广州中医药大学，广东广州  510006

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      【摘要】  【目的】观察5氮杂胞苷（5Aza）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外增殖和成肌分化的影响。【方法】无菌条件下取SD大鼠骨髓组织，采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs，传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后，随机分为4组：浓度为5、10、15μmol/L的5Aza组和空白对照组，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度5Aza对MSCs生长增殖的影响；以含5、10、20μmol/L5Aza的培养基诱导培养MSCs 24 h后，改用完全培养基继续培养，采用免疫组织染色法鉴定5Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白（myosin）和结蛋白（desmin）的表达情况。【结果】双标免疫组化染色结果显示：所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54，表达率达96%，鉴定结果表明所培养细胞为MSCs；5、10μmol/L5Aza对MSCs增殖无显著影响（P＞0.05），15μmol/L5Aza可显著抑制MSCs生长（P＜0.05）；不同浓度5Aza诱导培养MSCs后第3天，部分细胞出现desmin阳性表达，诱导后14d，部分细胞表达myosin，以10μmol/L5Aza组作用为佳。【结论】高浓度5Aza可抑制MSCs体外增殖；适宜浓度的5Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化。 0 O+ t4 Q5 H8 J. F2 y" I) j# A; G
      【关键词】骨髓间充质干细胞/病理学；  5氮杂胞苷/药理学；  细胞培养，体外的；  蛋白表达6 x8 e0 K% K( l( ]8 W- R5 v
   骨髓间充质细胞（MSCs）是干细胞中的一种，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点，能在一定的诱导条件下向成肌细胞分化［1］。本研究观察5氮杂胞苷（5Aza）对大鼠MSCs增殖与成肌分化的影响。现报道如下。

1材料与方法! N/ ~5 H: e" `4 |( b" `& O' C
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1.1动物纯种SD大鼠，SPF级，4周龄，体质量90～130g，用于MSCs的提取。由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：粤鉴证字2005A031SCX（粤）20030001。, V# P, S! Z8 R

1.2主要试剂与仪器IMDM培养基、特级胎牛血清（FBS）为美国GIBCOL公司产品；链霉亲和素生物素复合物（SABC）、二氨基联苯胺（DAB）染色试剂盒、抗体CD54、增殖细胞核抗原（PCNA）、生物素化二抗（羊抗小鼠）、DAB显色剂、5溴4氯3吲哚磷酸/氮蓝四唑盐（BCTP/NBT）显色剂均为武汉博士德公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）、5溴脱氧嘧啶（Brdu）及其单克隆小鼠抗体均为SIGMA公司产品；5氮杂胞苷（5Aza）、DHanks液、Tris盐缓冲液（TBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）、20g/L台盼蓝染液、2.5g/L胰酶、马血清均由广州威佳公司提供；鼠抗人肌凝蛋白（myosin）、鼠抗人结蛋白（desmin）为武汉博士德公司产品；BB36UU型CO2培养箱为德国Heraeus公司产品，设置37℃、CO2浓度为体积分数5%；CHK2FGS型显微镜为日本OLYMPUS公司产品；XDSIB型倒置显微镜为重庆光电产品；PE1420多功能微板分析仪为上海Perkin Elmer产品；超净台（PURIFIATION EPUIPMENT）为苏州净化设备有限公司产品；TGL16G型离心机为上海安亭产品；YH1401型电热恒温水箱为广州东方产品。

1.3MSCs分离及体外扩增取4周龄SPF级SD大鼠4只，100g/L水合氯醛腹腔注射以麻醉动物。无菌条件下取双股骨及胫骨，收集骨髓腔内组织细胞，将细胞悬液分装，2000r/min20min密度梯度离心2次，收取单核细胞层，加入IMDM培养液，打散成细胞悬液。细胞悬液用20g/L台盼蓝染液染色，计数300个细胞，调整密度，染色蓝色的死细胞小于5%方可继续实验，计数板计数，按1104个/瓶密度接种于75cm2培养瓶上，置于37℃、体积分数5%饱和湿度的CO2培养箱中培养，2d后半量更换培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3d换液1次，细胞培养7～10d后细胞密度较高，达90%融合后，弃去培养液，加入DHanks缓冲液进行冲洗，2.5g/L的胰蛋白酶37℃条件下消化5～10min，镜下观察消化控制时间，当细胞形态开始变化、变圆、漂浮、脱壁，立即加入血清终止消化反应。常规按1∶2或1∶3比例传代。

1.4双标免疫组化法检测传3代后的细胞种入装有IMDM空白培养基的24孔板中，24h后固定；0.01mol/LTBS洗10min 5min，体积分数3%H2O2洗涤10min，蒸馏水洗2min3次，正常山羊血清封闭20min，用去多余液体，一抗用多克隆兔抗，CD44、CD54（1∶100）4℃过夜（对照组不加一抗，加TBS），0.01mol/LTBS洗2min3次，生物素化羊抗兔37℃、40min，TBS洗2min3次，SABCAP37℃、40min，TBS洗5min4次，BCTP/NBT显色30min，双蒸水洗2min3次。双标阻断液30min，0.01mol/LTBS洗2min3次，正常山羊血清封闭20min，一抗用小鼠单克隆抗体（Brdu）1∶100于37℃、3h（对照组不加一抗），0.01mol/LTBS洗2min3次，生物素化羊抗小鼠IgG37℃、40min，0.01mol/LPBS洗2min3次，SABC试剂37℃、40min，0.01mol/LTBS洗5min3，DAB显色30～40min。中性树胶封片。! D) h8 }2 z3 X! ]6 w
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1.5MTT法细胞活性检测制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度1105/mL，接种于96孔板，1103个细胞/孔，每孔容积200μL，实验组浓度分别为5Aza5、10、15μmol/L，空白对照组为完全培养基。各组同时培养达72h后每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续在37℃培养箱内孵育4h，去上清，然后每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振摇10min，采用PE1420多功能微板分板仪于490nm波长处测光吸收值（D），以绘制增殖曲线。
5 Z% m3 _9 u4 g1 h( l; Z6 c
1.65Aza诱导MSCs分化MSCs传至第3代时，按1.0103个/孔，接种于预置盖玻片的24孔细胞培养板中，用IMDM完全培养基培养（1mL）；接种24h后，去除非贴壁细胞，分别改用含有IMDM完全培养基1mL以及含5Aza5、10、20μom1/L的诱导培养基继续培养24h，去除培养基，以PBS充分洗涤，改用完全培养基培养；对照组始终采用完全培养基培养，不加药物。- M, C  R1 t; O1 B0 M+ S6 P

1.7免疫细胞组化分析诱导分化3、7、14d后终止培养，取出盖玻片，PBS漂洗，40g/L多聚甲醛固定，体积分数3%过氧化氢封闭5～10min，滴加羊血清，室温封闭30min弃去，分别加入一抗工作液（myosin、desmin），4℃过夜，0.01mol/L的PBS洗涤液洗涤，滴加生物素标记羊抗小鼠IgG，DBA显色，或加用苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，试验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。观察诱导后细胞肌分化相关蛋白（myosin、desmin）表达的情况，并与阴性对照组及实验对照组进行比较。

1.8统计学方法所得数据用SPSS11.5软件进行统计。* [: U( v- N9 [' u
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　　2结果0 p. J7 P; C5 \* n4 O

2.1MSCs的分离与培养传3代后的MSCs细胞，在空白对照组（图1-a）及实验组中均可生长，在5Aza培养基中生长较缓慢（图1-b），其中15μmol/L5Aza组细胞培养3d后大部分死亡。  C9 o* j( `( t, z# I/ n

2.2MSCs双标免疫组化染色结果镜下可见，未使用CD44、CD54、Brdu标记的细胞未被染色，镜下为透明的细胞（图2-a），用CD44、CD54单标并经BCTP/NBT染色，再经Brdu双标DAB复染后的MSCs细胞表面被染成蓝色，细胞核被染成棕黄色，表达率达96%以上（图2-b），表明所培养细胞的确是MSCs细胞。7 E! j4 J/ z) A- R( e

2.35Aza对MSCs增殖的影响表1结果显示，5、10μmol/L的5Aza组与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05），15μmol/L的5Aza组与空白对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05）。表明5Aza浓度过高时，会对MSCs生长产生抑制作用。

2.4免疫组化检测结果应用不同浓度5Aza诱导MSCs24h，再换成完全培养基,诱导后的第3天,部分细胞出现desmin阳性表达（图3a）,诱导后14d,部分细胞表达myosin（图3b），阳性细胞主要见于10 μmol/L 5Aza组，未经诱导的细胞myosin及desmin表达均呈阴性（图3c）。表15Aza与完全培养基对MSCs增殖作用比较

3讨论) y( K: q6 n; j  x+ p8 H* l0 C! ?8 x
7 r- r" X( ]" C- [( P8 B
CD44和CD54是MSCs的重要标志物，它们属于细胞粘附分子，介导细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用。Brdu是一种胸腺嘧啶类似物，在DNA合成时可被细胞摄取利用而参与DNA组成，利用Brdu标记技术可以观察MSCs的分裂增殖情况，表明所培养的是具有分裂和增殖能力的MSCs。本文免疫细胞双标化学染色结果显示，所培养的细胞同时表达Brdu和CD44、CD54，表达率达96%以上。低浓度5Aza对MSCs的增殖作用不明显，5、10μmol/L5Aza组与空白对照组比较无显著性差异；当浓度增高，达15μmol/L时，对MSCs生长开始产生抑制作用，表明5Aza浓度过高时，会对细胞产生毒性。文献［1］报道5Aza对MSCs生长的促进作用在培养15d后才比较明显，作用浓度为5、10μmol/L。本实验由于时间和条件的限制，MTT检测的细胞培养时间均为3d，有待于以后继续完善。* ^; y1 W; R( Q: {% A& B

骨髓间充质干细胞（MSCs）的分化是一个极其复杂的过程，受到诸多调节细胞分化的基因调控，成肌细胞分化受到MyoD、Myf5、myogenin、MRF4等基因调控， MSCs分化是在多个转录因子的共同调控下进行的［2］。在肌分化过程中,首先是成肌细胞的定向分化,紧接着是myosin和desmin的表达,它们都是骨骼肌最早的成肌标志之一。同时，myosin和desmin分别是微丝和中间丝家族中代表肌分化的成员［3］。desmin是新生/成熟平滑肌、心肌、骨骼肌细胞中间肌丝的主要构成成分之一,其在心肌和骨骼肌均呈阳性表现，而成纤维细胞中没有表达。因此myosin与desmin的表达常用于MSCs向成肌方向分化的实验中。本实验应用5Aza对已传3代的MSCs进行诱导分化，结果经desmin、myosin抗体染色部分出现阳性反应，以10μmol/L浓度组为佳。表明一定浓度的5Aza可以促使骨髓间充质干细胞向成肌方向转化。
      【参考文献】% P! k9 y8 W' t# s
［１］王劲,郭朝华,张勇,等.5氮杂胞苷诱导间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究［J］. 中华创伤杂志,2003,19(4):207.
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: Q$ y6 ~, q; l) ~- v
［2］林先和,李隆.5氮杂胞苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化过程中PPARγ表达及其作用［J］.第三军医大学学报,2004,26(6):526.1 J$ \6 l" I3 M: q1 Z

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［3］Jennings CG. Expression of the myogenic gene MRF4 during xenopus development［J］. Dev Riol,1992，151:319.

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