IL5诱导CD34 造血干细胞嗜酸性粒细胞分化的信号传导机制研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:36 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：金莹  高欣  王颖作者单位：吉林省人民医院呼吸科，吉林  长春  130000 , y( P' B5 |4 m% o9 a! i, r7 v
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      【摘要】  　　目的  应用体外实验探讨骨髓中CD34 细胞定向分化为EOS的信号传导机制。方法  应用MiniMACS 磁性分离仪从体外脐血干细胞中分离CD34 细胞并应用流式细胞仪进行鉴定，将分离出的细胞进行培养并分成4组，即阴性对照组，定向分化组，和两种信号抑制组。各组细胞培养28 d后应用westernblot检测JAK1,STAT2的表达强度，同时观察各组CD34 分化为EOS的能力及EOS体外的活性。结果  在IL5诱导下CD34 细胞培养至第28 d时，EOS细胞已经占总细胞的872%左右，与B组比较，C组细胞在JAK1、STAT2表达强度、ES比例、EPO活性、Eos脱颗粒能力差异均有统计学意义（P＜005），与C组比较，D组细胞在STAT2表达强度、ES比例、EPO活性、Eos脱颗粒能力差异均有统计学意义（P＜005）。结论  体外实验CD34 细胞定向分化为EOS是通过JAK1STAT2途径介导的。JAK1STAT2途径不但介导了EOS细胞数量上的增加，而且介导了EOS细胞活性的增强。 1 A* `6 j' F, }) Q
      【关键词】支气管哮喘　CD34 造血干细胞　嗜酸性粒细胞　JAK1STAT2途径, m1 H, ^9 Y1 o- c! X
   　　近年来研究认为老年是支气管哮喘发病的第二个高峰期,成为老年高发的疾病,老年哮喘预后差、病死率高，积极寻找哮喘发病机制和有效的干预措施成为提高老年哮喘患者生活质量的有效途径〔1〕。研究表明，支气管黏膜组织中嗜酸粒细胞（EOS）的浸润与哮喘的严重程度密切相关，哮喘发作可能与肺和骨髓之间一种反馈的调节通路有关，这种调节通路最后的结果是促进了骨髓中CD34 细胞定向转化为EOS〔2〕。但具体机制并不明确，我们以体外细胞培养为模型，以白细胞介素5（IL5）为定向诱导分化因子，研究JAK1STAT2信号传导途径再造血干细胞在定向分化为嗜酸性粒细胞中所起的作用。  q+ ?$ m% F$ N( D/ Q0 M$ r' S5 y
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　　1材料与方法

　　11材料与试剂MiniMACS磁性分离仪(Miltenyi Biotec，Germany)；流式细胞仪(FACScan，BD，USA)；脐血采自吉林省妇幼保健医院(2104 U/ L肝素抗凝)；IMDM (Gibco，USA);IL5、CD34 、CD16一抗及相关二抗（BD公司）；羊抗人磷酸化的JAK1、STAT2单克隆抗体及相关二抗（Santa Cruz Biotech公司）；PVDF膜（北京鼎国生物有限公司）；DAB显色试剂盒(迈新公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(Amersham Bioscience公司)；JAK1 激酶抑制剂AG490、STAT2激酶抑制剂雷帕霉素(美国Calbiochem 公司)，血小板激活因子（PAF,sigma公司）；酶联分光光度计(biorad公司)。

　　12脐血单个核细胞及CD34 细胞的分离纯化采用吸附单克隆抗体磁珠分离系统（磁珠为直径50 nm 的羊抗鼠IgG1免疫磁珠）进行分离。脐血经Ficoll 分离液(相对比重为1077) 分出单个核细胞(MNC)，然后应用抗CD34抗体标记细胞。标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时，CD34 细胞被洗脱除去,将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集组分为CD34 细胞。分离后的CD34 细胞采用直接标记法标记上FITCCD34 单克隆抗体（1∶10），4 ℃标记30 min，洗涤两次，重新悬浮后用流式细胞仪检测。9 D; ]7 W: d+ G0 p

　　13细胞培养及分组以CD34 细胞108/L接种于培养瓶，培养液为IMDM中含体积分数为10%的小牛血清。将培养成功的细胞进行分组：A组：阴性对照组；B组：刺激分化组：培养同时加入IL5 20 μg/L；C组：JAK1信号抑制组：在B组基础上加入JAK1激酶抑制剂AG490，抑制剂应用IMDM调节成浓度为100 μmol/L；D组：STAT2信号抑制组：在B组基础上加入STAT2激酶抑制剂雷帕霉素（RPM），雷帕霉素应用IMDM调节为2 mmol/L浓度。每组细胞培养5瓶，所有细胞培养28 d后进行细胞分化的检测。

　　14Western blot检测将上述各组细胞（约5106个）用冰冷的裂解液（20 mmol/L TrisHCl,pH 74；1% Triton X100,25 mmol/L EDTA,01% SDS,10% glycerol,2 mmol/L Na3VO4,50 mmol/L NaF,1 mmol/L pepSTAT2 in,1 mmol/L PMSF,5 mmol/L leupeptin,100 U/ml aprotinin）冰上裂解40 min，13 000 r/min，4℃离心30 min，取上清细胞总蛋白。紫外分光光度仪粗测蛋白浓度，每个样品上样量为20 μg,12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDSPAGE）分离蛋白后将蛋白转移至聚偏(二)氟乙烯（PVDF）膜，一抗和二抗孵育后经DAB显色。结果采用Quantity One 软件进行灰度扫描半定量分析，以β肌动蛋白（βactin）表达为内参照。1 A* d( K6 l. ^

　　15细胞分化的鉴定6 ~0 d! C3 }! g

　　151苏木素伊红（HE）染色将收集的培养细胞涂片，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后,用丙酮甲醇混合物固定,做常规HE 染色。以细胞内出现嗜伊红颗粒为EOS随机计算200个细胞,记录典型EOS 的比例。
4 F& G, G) y8 [. }
　　152流式细胞术检测EOS细胞用PBS将EOS调节为1105个/ml细胞悬液，加入鼠抗人CD16单抗，4℃孵育30 min，用含有5%胎牛血清的PBS洗脱未结合的单抗2遍。加入FITC荧光标记的羊抗鼠IgG，4℃孵育30 min，用PBS洗涤、离心1 500 r/min,5 min2遍后进行流式细胞仪检测，CD16-的为EOS。$ _  [' m" O. P/ Y2 K
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　　16分化的EOS的功能测定
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　　161EOS过氧化物酶(EPO)活性的变化取1109细胞／L EOS细胞悬液1 ml加入6孔板中，然后以PAF(终浓度为10-7mol／L)孵育30 min。按Strath〔3〕方法测定EPO活性。用酶联分光光度计，在492 nm处测OD值，以OD值表示其活性。: f7 ?! q2 W1 }

　　162Eos脱颗粒的变化在Eppendorf管加入EOS(1109细胞／L)180 μl,置37℃孵育24 h，以PAF (终浓度为10-6mol／L)孵育30 min，然后以5 000 r／min离心5 min(20℃)，弃上清用PBS轻轻洗涤管底细胞团二次，重悬于200μl Hanks液中，用超声粉碎仪5 min破坏细胞，按文献〔3〕测EPO。( r8 E/ D/ v4 A7 t. [* {  `! t2 C

　　17统计学处理采用SPSS130数据软件统计，所有计量资料采用x±s表示，首先进行方差分析，根据方差分析的结果选择t或t′检验。

　　2结果

　　21各组细胞JAK1、STAT2、ES比例、EPO活性、EOS脱颗粒能力比较见表1。
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　　表1各组细胞JAK1、STAT2、ES比例、EPO活性、EOS脱颗粒能力比较（略）

　　与A组比较，1）P＜005；与B组比较，2）P＜005，与C组比较，3）P＜0051 h( L0 d; _3 h! R- e1 y( O7 g/ k5 Q3 u

　　图1IL5诱导下CD34 细胞培养至28 d （略）
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　　图2流式细胞仪检测细胞结果（略）8 w5 h' a' W4 C  o% _0 X. J4 o# K
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　　22细胞鉴定HE 染色可见在IL5诱导下，CD34 细胞培养至28 d 时已大部为EOS（见图1）。

　　23流式细胞仪检测细胞脐血干细胞中分离CD34 细胞的纯度可见大部分是CD34 细胞；IL5诱导下CD34 细胞培养至28 d时大部分为CD16-的细胞，见图2。! O+ y* a; V( B; h! B2 U- V
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　　3讨论3 q' B4 Z2 D3 Z# w* |
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　　随着对哮喘气道炎症骨髓反应机制研究的深入，认识到哮喘发作可能与肺和骨髓之间一种反馈的调节通路有关：哮喘患者体内促使骨髓源性炎细胞干细胞产生的触发物增多，激活骨髓中特定的造血途径，从而使骨髓EOS祖细胞分化反应增强，使EOS产生增多，释放入血后经趋化因子等的作用大量聚集于肺组织，肺组织局部的EOS再释放细胞因子，诱导骨髓源性炎细胞干细胞发生定向分化。这种肺和骨髓之间反馈调节在维持哮喘慢性气道炎症中具有重要作用。因此EOS祖细胞及其分化的调节因子成为哮喘等变态反应性疾病治疗的新靶点〔4，5〕。脐血含有丰富的造血干/祖细胞，借助于体外细胞培养技术，可以进行分化调控的研究。已知有多种细胞因子参与EOS 的生成和趋化,其中以IL5 最为重要。多项研究证实，IL5 能特异性诱导骨髓CD34 造血细胞分化为EOS。研究发现，IL5Rα是EOS 祖细胞的特征性标志物,表达IL5Rα的CD34 造血细胞可能就是EOS 祖细胞〔6〕。我们在体外应用脐血为CD34 造血干细胞来源，应用IL5为诱导因子条件下，成功培养出EOS细胞，经HE染色和流式细胞鉴定结果发现培养28 d后其纯度可以达到872%左右，这说明应用IL5体外刺激CD34 诱导产生EOS是方便可行的。我们的实验同时发现，B组细胞在JAK1、STAT2、ES比例上均较A组有显著性差异，这说明了在IL5刺激下CD34 细胞JAK1和STAT2表达均上调，且在此基础上刺激了CD34 细胞分化成为EOS细胞。C组细胞加入了JAK1抑制剂后JAK1、STAT2、ES比例、EPO活性、EOS脱颗粒能力均有所下降，与B组比较，差异均有显著性差异（P＜005），这显示抑制了JAK1活性后，不但EOS增殖数量有所下降，而且其活性也明显受到了抑制，说明EOS数量和活性上的增加都是通过JAK1途径介导的，从D组的结果上来看，抑制了STAT2活性后，JAK1、STAT2、ES比例、EPO活性、EOS脱颗粒能力也有所下降，与B组比较差异显著（P＜005），这说明STAT2途径也参与介导了EOS数量和活性上的增加，但是其下降的幅度与C组比较，差异也有显著性（P＜005），抑制JAK1，JAK1、STAT2表达及EOS数量和活性下降比较剧烈，而抑制STAT2，JAK1表达没有变化，EOS数量和活性下降比较轻微，这充分说明了，JAK1在信号传导通路上处于STAT2的上游，抑制JAK1对STAT2有连动效应。我们此次的研究说明了JAK1STAT2信号通路在IL5诱导下CD34 细胞分化成EOS过程中起重要作用，而且JAK1STAT2不但介导了EOS数量的增多，还介导了EOS活性的增强。! ^; S$ E, s- p7 s, M
      【参考文献】$ ]  J. l9 O% X- s. Y
　　1  Joachim RA,Quarcoo D,Arch PC,et alStress enhances airway reactivity and airway inflammation in an animal model of allergic bronchial asthma〔J〕Psychosom Med,2003;65(5):81158 X/ s0 ]% p" n( o" i" |' h
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　　2  毛  辉，王曾礼CD34 细胞与支气管哮喘〔J〕国外医学·呼吸系统分册，2002;22（4）：1902' M0 ~1 y2 p' d3 W
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9 i+ Q) r3 s' t

　　3  Strath M，Warren DJ,Sanderson CJDetection of eosinophils using an eosinophil peroxidase as sayIts use asan assay for eosinophil differentiation factors 〔J〕J Immunol Meth，1985;83：20915
( y1 [7 K/ k, d0 o( ~

　　4  杜建新,郭其森,鞠兴东,等支气管哮喘患者外周血CD34 细胞、白细胞介素5和嗜酸粒细胞的变化及其意义〔J〕中国呼吸与危重监护杂志，2005;4（2）：119217 k# T+ k9 B* M+ k# P% H  f" ^
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　　5  吴昌归，毛宝龄,孙  滨血管活性肠肽对嗜酸性粒细胞释放和黏附功能的影响及机理〔J〕中国应用生理学杂志，2000;16(3)：23941; ^! [/ o2 n4 @' U  t& r/ i& ?
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　　6  张  辉,张大良,郭成浩人脐带血CD34 细胞体外诱导分化为嗜酸粒细胞的研究〔J〕中国病理生理杂志,2006;22(5)：87880- U1 n* r8 S9 E9 A

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　　(编辑  章  木)

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