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作者：蔡惠美作者单位：东南大学 临床医学院，江苏 南京 210009 # f# W3 a% l* H$ {: m
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4 e7 t5 _9 I [# x9 ?5 K2 N 【摘要】 目的：观察胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对局灶性脑缺血大鼠在体海马齿状回脑电活动的影响。方法:制作右侧局灶性脑缺血模型，右侧脑室注射GDNF，通过神经电生理学方法，记录正常组、脑缺血模型组、生理盐水组和GDNF组大鼠局灶性脑缺血90 min后再灌注14 d海马齿状回的脑电活动，分析脑电频谱。结果:免疫组化检测显示，GDNF组各时间点BrdU阳性细胞较脑缺血模型组和生理盐水组增多。大鼠脑电图显示，GDNF组较脑缺血模型组和生理盐水组脑电活动恢复明显，组间比较有显著性差异（均P# U f/ n+ a U$ V' s. x6 W
【关键词】局灶性脑缺血 海马齿状回 神经干细胞 胶质细胞源性神经营养因子 脑电活动 频谱分析
1 K1 I! v1 [. |- u: f 近年研究证实，脑缺血损伤能促使特定生发脑区的内源性神经干细胞（neural stem cells，NSCs）增殖、迁移，最终分化为终末神经细胞[12]。但是，哺乳动物中枢神经系统损伤后,内源性修复能力不足，不能启动功能性轴突的再生，是脑损伤的替代治疗中亟待解决的问题。对脑缺血后脑内微环境的研究提示，神经营养因子不仅可促进神经系统发育，还对脑损伤的修复起重要作用。最近研究[34]发现，胶质细胞源性神经营养因子（glial celllined derived neurotrophic factor,GDNF）能够促进多种神经元的存活和分化，但GDNF对脑缺血后内源性NSCs增殖分化的作用机制尚不明确。本课题组在对脑缺血后内源性NSCs再生的研究中证实，GDNF能促进海马齿状回颗粒层和颗粒下层NSCs的增殖、分化，并通过Y型电迷宫验证其对脑损伤后的学习与记忆能力的恢复有重要作用[5]。本研究采用神经电生理学的方法，记录脑缺血后GDNF对在体海马齿状回的脑电活动，并进行频谱分析，旨在进一步验证脑缺血后GDNF促进内源性NSCs增殖分化和对脑缺血的修复作用。
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3 ]# u, [8 `4 m) ?+ H1材料和方法
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2 A: E* y0 o, M1.1实验动物、主要试剂及检测仪器
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: H6 f* c, u8 Z6 K8 {选用成年雄性SD大鼠(由东南大学医学院实验动物中心提供)，4月龄，体质量340 400 ｇ。GDNF由晶美公司提供。江湾Ⅰ型C立体定向仪由中国上海第二军医大学提供，MD2000 Super Lab生物信息采集分析系统由南京医科大学生理学教研室提供。0 e$ D9 P8 ^* @& c- K. v3 T$ z
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1.2局灶性脑缺血模型制作及实验分组! {, o% t# j, u5 }
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参照Longa等[6]线栓法制作大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。缺血90 min后，回抽尼龙线10 mm，完成再灌注后缝合伤口。观察模型大鼠清醒后的行为学改变，按Zea Longa五级评分标准评定动物的神经系统体征:0级,行为无明显变化；1级,左前肢屈曲，左后肢伸展；2级,有左侧追尾现象；3级,行走困难，摇摆不定；4级,无自发性活动，有意识障碍。本实验将1、2、3级大鼠确定为成功模型鼠。将模型鼠随机分为正常组、脑缺血模型组、生理盐水组和GDNF组，均于脑缺血再灌注第2、7、14天检测脑电活动，各时间点大鼠6只。
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1.3侧脑室注射GDNF
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5 Y: U, `3 e# ?5 x1 R; q c: @* T在造模前3 d，4%戊巴比妥钠腹腔麻醉下，将大鼠固定于脑立体定位仪上，参照Paxinos和Watson图谱第2版，取右侧脑室坐标为：以Bregma点为零点，AP=-3.8 mm，ML=-1.6 mm，DV=3.6 mm。颅骨钻孔置入金属双套管于右侧脑室，牙科水泥封闭骨孔和外套管。造模后即拔出内套管，GDNF组以1 μl·min-1、12 μl·（次·d）-1匀速注入0.1 mol·L-1 PBS和1 μg·ml-1 GDNF溶液，在检测脑电活动的各时间点前每天连续给药。注毕,将内套管插入外套管以封闭开口，按再灌注时间点连续注射至处死前1天。生理盐水组以同样方法等量注入生理盐水。
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1.4海马齿状回细胞增殖的检测[5]5 ]( z: ^2 f J, l9 @' Q
& F% H: F, P- _, U- ]: x各组大鼠在相应时间点处死前24 h后，腹腔注射BrdU(50 mg·kg-1),1次·h-1，共3次，末次注射12 h后处死。常规取材，选择海马齿状回部位，在恒冷式冰冻切片机上作连续冰冻冠状切片，片厚20 μm，每隔4张取1张贴片，进行免疫组化（SP法）检测。在加一抗前，切片作如下处理：50％甲酰胺/2SSC、2 mol HCl、3%H2O2（37 ℃，15 min）、0.1%胰蛋白酶、正常羊血清封闭后，入小鼠抗大鼠BrdU抗体(1∶500，Sigma公司提供)4 ℃过夜,最后DAB显色。常规脱水、透明和封片，光镜下观察。任取一张切片用正常羊血清代替一抗进行阴性对照实验。# v5 [6 }0 t7 ` ^- y
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1.5海马齿状回电极的埋植和脑电活动的记录及频
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. `8 N8 t2 b e2 m, ^* b% @/ P谱分析各组大鼠在造模前3 d，右侧海马齿状回的定位坐标为：AP=-3.8 mm，ML=-1.6 mm，DV=3.6 mm。埋植不锈钢针记录电极(直径0.3 mm,尖端裸露0.3 mm,其他部位绝缘)，实验结束后用美蓝法验证电极植入的部位（图1）。实验时将参考电极（与记录电极性质相同的不锈钢电极）埋置于头皮下，接地电极插入下肢皮下，记录电极用牙托粉加502胶水固定。3 l9 B$ H+ v$ D7 Z1 ^# k
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海马齿状回的脑电活动采用MD2000生物信号采集系统记录。大鼠在造模24 h后进行1次脑电活动的记录，采集至少要持续0.5 h，并在第2、7、14天以同样方法分别记录脑电活动。记录后对海马齿状回脑电活动进行频谱分析。频谱分析指标与预值置为：频率范围0 100 Hz，频率分辨率0.195 Hz。/ Z, M9 L8 Y6 ^$ Q+ a2 H3 h$ N
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1.6统计学处理. e3 K& |" u; P$ O) _' R: G4 f
$ i$ j/ {9 u& I4 `5 B) i数据以x-±s表示，应用SPSS11.5统计软件，组间比较采用方差分析，同一时间点间的两两比较采用t检验，检验水准α=0.05。" ?; y! `; [8 W& x6 ^. }
/ R9 m! H5 l5 T/ _2 a3 K2结果2 r4 g9 h( m/ b- q6 x' v9 c% h
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2.1行为学变化及美蓝染色鉴定4 R( D; N; ]) g! C
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术后大鼠右眼虹膜颜色变浅，眼裂变小，瞳孔缩小，行走困难，摇摆不定，左侧偏瘫,以左前肢屈曲、左后肢伸展明显，提尾悬拉后出现向左旋转。取脑后，见右侧半球明显肿胀，以视交叉前缘向前5 mm、向后8 mm为肉眼所见脑梗死区的定位（图1）。美蓝染色显示右侧海马齿状回蓝染，范围在3 mm3 mm，电极的植入部位准确。3 l$ u, y) o: L* f" t
* d$ K {* m$ g2 g5 m% b2.2免疫组化检测
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GDNF组各时间点BrdU阳性细胞数与模型组和生理盐水组相比有显著差异，在术后3 d，BrdU阳性细胞数明显增多，14 d达峰值。BrdU阳性细胞可见较大而深染、呈圆形胞核和淡染、呈椭圆形的胞核（图2）。& V- s3 h: {0 K7 R+ Y! r) ]+ |3 V& R
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图2术后14 d GDNF组BrdU4 j1 l! v. v) u2 r8 Z; B
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阳性细胞SP100
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2.3脑电图及频谱分析8 Q! }' K* ?. d( z" b
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正常组在麻醉状态下海马齿状回EEG主要以慢波θ、δ为主，处于抑制状态，各波的功率平均值见表1。脑缺血模型组和生理盐水组大鼠在麻醉状态下，海马齿状回的EEG表现为频率较高的α、β1、β2波所占百分比均升高，低频的δ波所占百分比均降低，主要以慢波θ为主，也处于抑制状态，各波的功率平均值明显减小；GDNF组大鼠在麻醉状态下，EEG显示与正常组相近，也是以θ、δ为主，各波功率平均值较缺血组均有所上升。脑缺血模型组与正常组相比，P& {# [8 T, }. \, u; B2 U4 ~
, N$ F) E( G) Y0 Q, q3讨论
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有研究认为，脑缺血后内源性NSCs在脑内微环境中许多因素（如神经营养因子等）的作用下，可被诱导而增殖、迁移和分化，但存在内源性神经营养因子时空分布上的局限性和局部浓度较低，不能解决内源性NSCs替代因脑损伤导致的大量神经细胞丢失和功能恢复的问题[14,8]。本课题组以往的研究[5,7]证明外源性给予GDNF可以增强内源性NSCs增殖和分化。本实验结果显示，在麻醉状态下，海马齿状回处于抑制状态，均以慢波θ、δ为主，但各波的平均频率有显著差异。如表1所示，脑缺血组慢波θ、δ的平均频率依次为11.22、9.90，与正常组的θ、δ平均波频26.27、14.97相比明显降低。可见脑缺血后海马齿状回脑电活动明显衰减。而GDNF组与正常组和脑缺血模型组比较，在同样的状态下GDNF组各波的活跃性有较显著的提高，可见GDNF 对脑缺血具有保护作用，可减少缺血后的脑损伤，促进海马齿状回脑电活动增强，并逐渐恢复正常。在神经电生理学上，EEG的脑电波由高振幅、低频率转化为低振幅、高频率时，称为去同步化，表示神经核团的兴奋过程增强。反之，由低振幅、高频率转化为高振幅、低频率时，称为同步化，表示神经核团的抑制过程加深，能较好地反映在体神经核团功能活动状态。注入GDNF后海马齿状回脑电活动明显恢复，能很好地说明GDNF对脑缺血大鼠的行为、功能和形态改变的改善[5]与脑电活动变化基本一致。因此，本研究推测外源性给予GDNF能促进脑缺血后海马齿状回脑电活动增强，对脑缺血后的行为、神经功能和形态改变有所帮助，其机制可能与减少细胞凋亡和促进海马生发脑区内源性NSCs的增殖和分化有关[7]。通过对神经干细胞在体的适当诱导，应用GDNF或配合一定的药物，可能很好地改善缺血区的脑内微环境，提高对脑缺血的治疗效果。( V& g' B- I: @4 F! x
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发表于 2009-3-3 12:37
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