体外诱导人脐带血间充质干细胞为软骨细胞的初步研究

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作者：农丕地 解继胜 黄海玲作者单位：广东佛山市南海区桂城医院，广东佛山528200 5 @) _9 ~0 i) `! T- O1 {$ p& H. M
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          【摘要】  目的  探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)体外诱导人脐带血间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化的可能性。方法  由人脐静脉获得MSCs，纯化培养后用含100ng/ml IGF-1的培养基诱导，扫描电镜鉴定诱导后细胞。结果  来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞，间充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态。IGF-1诱导16天后，MSCs开始呈现软骨细胞特点。结论  人脐带血MSCs可在体外经IGF-1诱导为软骨细胞。
$ f9 B& z; N# z          【关键词】胎血 间质干细胞 软骨细胞 细胞分化 胰岛素样生长因子Ⅰ7 A& H) Q% t' V6 h' h0 w9 F
                  　　IGF-1 induced condrogenic differentiation of mesenchymal
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stem cells isolated from human umbilicl cord blood in vitro. K, y0 A; y5 K9 [( R

' i+ v. O  X) D8 ~NONG Pi-di1, XIE Ji-sheng2, HUANG Hai-ling2
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　　1. Guicheng Hospital of Nanhai District, Foshan, Guangdong 528200, China;3 s) _& L6 b( N, m
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　　2. Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, China
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Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord blood (HUCB) differentiating into chondrocytes in vitro.MethodsMSCs isolated from HUCB with Percoll density gradient solution were culture-expanded because the cells attached and grew on dishes, then MSCs were induced with 100 ng/ml insulin-like growth factor Ⅰ (IGF Ⅰ). The differentiated cells were identified by using scanning electron microscope (SEM).ResultsThe HUCB-derived mononuclear cells, when set in culture, gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast-like or mesenchymal-like phenotype. 16 days after IGF Ⅰ medium treatment, MSCs in monolayer cultures exhibited a chondrocytic phenotype.ConclusionMSCs can be cultured and differentiated into chondrocytes induced by IGF Ⅰ in vitro.* B, B3 U( z) A/ {
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Key words:fetal blood; mesenchymal stem cells; chondrocytes; cell differentiation; insulin-like growth factor I
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# o  q" ]/ n/ C* U! }! M( G6 |9 x间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为一种多潜能干细胞，因其成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多问题在实验研究和临床应用中的限制，近年来已成为干细胞领域的研究热点。其不仅支持造血系统，还可向中胚层和外胚层来源的组织分化，在一定的实验条件控制下可分化为肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞等［1～3］。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的MSCs来源，已越来越受到各国学者的关注。人脐带血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞，主要包含造血干细胞和MSCs。脐带血中的MSCs可在体外培养，诱导分化后能成为神经细胞、心肌细胞等［4,5］。随着组织工程学研究的深入，对于相关功能细胞研究逐渐扩展到干细胞领域，MSCs对软骨组织修复有重要意义，本实验主要探索人脐带血MSCs的分离培养以及分析其向软骨细胞分化的可行性。5 R; S# O% H/ S. }8 @2 V2 N

& w0 g- c8 O, }8 {: P　　1材料和方法
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　　1.1材料
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" z, h$ @( H1 s; c　　主要试剂和仪器：Dulbecco改良培养基（DMEM）、胎牛血清（FCS）均为HYCLONE公司产品；胰岛素样生长因子-1（IGF-1）（美国SIGMA公司）；Percoll分离液（PHARMACIA公司）；其它试剂均为国产分析纯试剂。CO2培养箱（SHELDONA公司）；AE31型倒置显微镜（MOTIC公司）；Apollo 300型扫描电子显微镜（英国APOLLO公司）。
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! `$ {2 [- `# m  s　　1.2方法
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8 N4 @' z! E9 S+ t　　1.2.1脐带血MSCs的分离培养; p/ f( {0 g9 y/ S& `+ S

: d$ ], B# X8 }8 Y' o　　从无妊娠并发症足月分娩的脐静脉穿刺抽取15ml脐带血，肝素抗凝，加等量磷酸缓冲液稀释，取50ml离心管，先加入15ml密度1.077 g/ml的Percoll梯度分离液，小心加入稀释后的脐带血，2000r/min离心25min后，用吸管吸取分层界面的白色环形絮状物（富含单个核细胞），洗涤离心2次（800r/min5min），沉积细胞用含15％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为1106个/ml，接种于25T的培养瓶内，放置在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。孵育72h后更换培养基，去除红细胞及其它未贴壁细胞，以后视细胞生长情况平均3～4天换液1次。
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　　1.2.2脐带血MSCs传代培养  O% S, U' q0 h! z" [0 f+ T
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　　MSCs 约于7周相互汇合达到培养瓶底70％～80％的生长表面，此时进行传代培养。倒掉旧培养基，加入2ml 0.25％的胰酶消化，作用30s后弃掉大部分，留置少许于瓶中，适当用力振荡培养瓶，整瓶细胞放入培养箱中5min，在倒置显微镜下观察细胞解离程度，以细胞突起缩回，细胞间隙增大，细胞近乎圆形为度，加入含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，用吸管轻柔吹打瓶底，收集细胞，洗涤离心（800r/min5min），接种于置有盖玻片的24孔培养板中。6 Q' u  P9 p. F2 s" a. N

  }4 |, f$ t( k　　1.2.3脐带血MSCs诱导培养
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　　取第2代细胞按密度为5104/ml接种于24孔培养板(孔内置无菌盖玻片)中，第2天换液，其中半数培养孔用诱导软骨细胞培养基(15％FCS的DMEM含终浓度为100ng/ml IGF-1)进行培养，3天换培养液1次，连续观察细胞生长情况，并于第16天获得细胞，通过扫描电子显微镜进行形态学检测。
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* ^2 N4 e0 B- S7 ^+ k　　1.2.4软骨细胞检测, ^# e$ D) I) Y* i

$ }; j& |% j/ C　　1.2.4.1活细胞观察
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　　诱导后，每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，特别注意其形态的改变，记录可见变化特征及其出现时间，拍照。) b. n0 z4 n7 D, Q* O+ [! U
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　　1.2.4.2扫描电子显微镜观察# [- p" b& G# N) S8 I0 ^$ v
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　　诱导培养16天时，以磷酸缓冲液轻轻冲洗，2.5％戊二醛固定，酒精梯度脱水，室温干燥后表面喷镀金，扫描电子显微镜观察。; `, h5 {1 _. G1 x* d* t
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　　2结果2 ~7 }& a& g  P) E; Z2 T# G
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　　2.1形态学变化+ O" H$ d8 H4 M9 h1 u9 V
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　　脐带血MSCs接种24h，仅见少量贴壁细胞，近似圆形或短梭形，48h后贴壁细胞逐渐增多，细胞渐变长，3天后换液，除去绝大部分悬浮细胞，可见分散的MSCs小集落，集落细胞呈放射状生长。随着培养时间延长细胞集落增大，细胞形态为长梭形，6～7周细胞集落彼此融合，呈旋涡状或菊花状生长。细胞传代后，7～8周细胞基本融合成层（见图1）。脐带血MSCs经诱导培养后，细胞形态由长梭形渐变为圆形或椭圆形，可见分泌少量细胞外基质，以后渐变为多边形或立方形、三角形(见图2)。( Y# `  o' C( U3 i$ Z6 q" |9 B

, h6 K; H7 M* S' j- Y, C% z　　2.2扫描电子显微镜检测结果8 o0 T: |7 N4 s

: w& v& Z" M5 b　　可见细胞呈多边形，外围为分泌的细胞外基质所围绕，呈蜘蛛网样（见图3）。
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* V, m  [: d2 v3 |, @2 L　　3讨论
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软骨组织工程的种子细胞来源主要有胚胎软骨细胞和MSCs等。胚胎软骨细胞虽然具有良好的软骨细胞活性，但来源有限，大量分离获取困难，体外大量扩增的潜力不足，故不能满足软骨组织工程临床应用的需要；MSCs作为一种多潜能干细胞，因其成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、伦理道德等诸多问题在实验研究和临床应用中的限制，近年来已成为干细胞领域的研究热点。其不仅支持造血系统，还可向中胚层和外胚层来源的组织分化，在一定的实验条件控制下可分化为肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞等［1～3］。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的MSCs来源，已越来越受到各国学者的关注。人脐带血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞，主要包含造血干细胞和MSCs。脐血中的MSCs可在体外培养，诱导分化后能成为神经细胞、心肌细胞等［4,5］。与骨髓相比，脐血有更充足的来源，脐带血中干细胞含量丰富，明显超过成人外周血含量，相当或超过成人骨髓中的含量［6］。同时，脐带血具有以下特点：①脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单。对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受。②脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的机率低。③脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应。④脐血包含丰富的MSCs，不仅可用于造血系统疾病，也可用于非造血系统疾病的治疗。⑤脐血中含有的丰富干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的分化能力。⑥脐血中不会有肿瘤细胞［7］。⑦不涉及社会、伦理及法律方面的更多争论。⑧收集的脐血不仅可做异基因移植的供体，而且还可将之低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。由于MSCs具有多方向分化潜能，如何定向诱导其分化为软骨细胞是解决软骨组织工程中种子细胞来源的一个前提。本实验采用Yan H等［8］描述的软骨细胞诱导方法，实验中我们发现，脐带血MSCs经诱导培养后，细胞形态由长梭形渐变为圆形或椭圆形，可见分泌少量细胞外基质，以后渐变为多边形或立方形、三角形，扫描电子显微镜检测诱导细胞具有软骨细胞形态学特征。  m5 A$ w! a1 W* ?$ x- {/ `

8 w* {5 r# c7 Y% R5 `$ D. J0 d' }本实验证实从少量人脐带血中获取MSCs，在条件培养液诱导下，短期内可获得大量软骨细胞，可以考虑作为软骨组织工程种子细胞的来源。+ {: P4 O5 Y( B9 q: p

1 q2 M+ |9 q+ I; g骨关节炎是骨科临床的常见疾病。由于退行性病变、创伤等造成的关节软骨缺损，已成为导致残废、影响生活质量的重要原因。关节软骨是一种无血管组织，软骨细胞主要靠关节滑液及细胞周围的基质供给营养以无氧酵解供能，其自身的修复能力很有限。临床最有效的方案是以细胞为基础的治疗方法，即植入软骨细胞或组织工程化软骨。由于自体软骨来源极为有限，并存在增加患者痛苦及并发症的危险，不易被患者接受，因此该方法难以广泛应用；同种异体、异种软骨组织移植，虽然移植的软骨可生存很长时间，由于种种原因至今未得到广泛的应用，关节软骨的移植治疗受到诸多限制。利用组织工程方法，获得可用于移植的软骨组织，即组织工程化软骨，作为一种创伤小、副作用少，且方便适用的软骨缺损的修复方法是未来发展的方向，因此寻找合适的种子细胞，提高组织工程化软骨的成软骨效能具有重大意义。3 ]" I' _2 `/ s3 s9 \2 a9 d, |

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