求助胚胎干细胞培养方法

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* U3 c! p+ T+ u8 {

, k3 r. i+ f4 V8 P1 b7 d培养条件
% K" i- [+ E: E# ]4 e环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。 # X/ q2 f! h5 N. d$ [
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
2 O" g+ E4 N' ^: B4 c# R" _: S实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 4 p0 M. M* T- s8 [9 w' p
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。 : Y/ T% T% z/ l; q
试剂的配制：
) x8 n' m, x% M" @$ q- x  q+ fDMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3 8 \  X; Z9 }1 q' v% ^
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素 $ D9 v& S/ B- c8 y4 o
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子 0 v0 F; l$ D6 F. X& D
D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红 9 c$ d0 H0 ?( F3 ~2 ?
0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶
$ l1 W6 g7 p8 }ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO 5 b, l. W, t& n1 R$ ~
MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO   G; E) [4 W9 o/ p7 s7 G. h  Y
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
# O! k2 S2 s1 a; u3 [丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制 1 Z$ P2 H8 a( x* [& s9 C0 G
培养步骤
& E: L- D1 d# F4 E/ T常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 ! M7 x1 i9 g) z+ d+ O7 _6 l3 {  g( [
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 / H6 S  L2 I; ^

$ V9 G( M6 N7 V9 M$ p( `! f: _2 X在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 - o" Y& P. Y* G5 p( }
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
" E' b' K! w0 k% b$ e7 j3 N/ {吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 $ K+ s" T" r! a  a9 `% X% Y
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 & t/ w- I6 @2 x8 F" z$ p2 T
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 8 @2 D% W5 K, @" Z. C  ?
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
; ]7 s( X# n& [( D5 d" |8 F把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
" v% n  F/ f) _( b+ k7 t用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
. N4 u5 l5 Z  t* [; Q5 b; \去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 7 a- V( ^) W7 x3 h7 G" V; E# X
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
* S3 w" ~. W6 L' q小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
2 \2 d3 F' g- ^4 i) t0 C8 O在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
" k5 b$ o5 T" m5 F  ?把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
3 Q" k+ g# k* x; D* b吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 . D9 s# i& N  O- A; `
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
4 x) J9 Z/ Z* K: i5 y/ x小鼠胚胎干细胞的传代
; B! q; r0 \* Z  p/ p吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
4 k1 {0 d, @* z( B用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 & N8 o& k) E  l' _1 N
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 4 M' e' g( c, r$ i8 L
小鼠胚胎干细胞的冻存 - m0 J- q5 X7 h
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 : V7 k' u0 _6 `+ q: G6 g" w" {
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
3 ]- J  P% H# m' j2 N7 t去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
) q8 i6 f* v2 O' ~+ m3 z  ]+ Y0 ?注意事项 " v5 N7 m8 ]6 b- e% s8 Q& j
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 ; ]5 X' y6 K( q
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
6 T! Y0 _# t; R/ Z* N) a) s( RES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。 + {# j, J* p  W# z5 N& f8 d/ O) i5 b
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。