|
- 积分
- 3
- 威望
- 3
- 包包
- 89
|
本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:31 编辑 * K- D- m5 V7 f, o1 M$ D+ k
+ S! i6 N+ \0 j6 {
6 ]% ^6 R$ e: x/ j4 ^. n
培养条件
5 X1 V( Y: K6 I2 ~0 t环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
c# {" o4 R( {! A9 D设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
8 D1 l% M, O0 R实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。
2 \% n. c; o8 {' t3 ]试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
. h3 L) k: h- F) W0 s试剂的配制： 0 O s/ c7 \+ Z# B" \, b# F! J* l
DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3 - {5 L7 M# j4 C2 o! ]
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素
3 n! K2 S9 m$ x8 F: E5 R( _$ C/ `ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子
4 Z T* J& W9 B" c3 n RD-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红
1 w# O* W& a9 b0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶 2 `( j0 R# y# p G! H& g/ U
ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO
. ^8 U0 \) P- QMEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO % m( [' Q. p5 p
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO 7 o6 H* t# I$ J( ?! s& N( E" f. I7 Z
丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制
4 Q4 |( Q$ _ u! C培养步骤
4 P6 x% q5 L; B/ f' l. L常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
, e& u: a1 Z; m' T+ J: Z+ `$ T
/ e, Z: v5 f% [+ P1 P小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
5 ^7 d% Y& W9 y0 Z胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 - ]+ o0 ], V( h% ?0 B
1 J# E5 }+ @2 J' ~6 g: D在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 $ D) e/ R9 G7 i5 r
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
5 B1 I! E+ L- O吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
9 a# I" e/ |& { d" N6 p! D6 H: {* m根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 ! @* u' E) Z' \6 W* o' z( c
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
. L, R* ]7 O6 {* Q把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
' _8 I: H8 H; r8 D把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
8 a3 D5 [9 s6 T* l# N用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 9 q" J9 p- u8 d4 E! L
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） * w! }* `( q: i$ d% h H
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 # {* z$ ]$ W2 n4 K0 v; m* R
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 3 ?5 C% X3 [5 m z l8 [0 B
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 $ X: ^/ Y! U4 e' I, L/ ]
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
; J& |* {& m6 Z& A4 @* e6 N$ y9 A吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 + o% \& g) y, |* Y$ Q2 m# d+ ~ I
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
) h% F Q: }' b/ Q小鼠胚胎干细胞的传代 " G- W& H0 n6 q2 x1 A. l! p
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
' n/ r% Q) B' P% H! v8 X用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 / q* Q$ A! G9 o' q4 ?" s% e
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 5 c+ G; r, n* L, p. a, i
小鼠胚胎干细胞的冻存
. ~4 G3 M! @- X8 C( E- K1 o吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 $ W0 @1 H$ D# \8 i9 E" s
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
" ?9 n% h: K/ V去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
0 X# F; m+ j" _; Y2 u注意事项
/ ]9 d [: w2 P5 @+ U! W+ l( q丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
T, g% P) [% Y D7 oES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 : \9 r% F* p5 K1 r* P4 ?$ m
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
! F* N! {0 b/ Z3 V3 e* q9 w. P为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。 |
|
发表于 2010-12-15 10:00
发表于 2010-12-15 11:13
