人胚胎干细胞培养

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3 [- k% N/ z  T+ ~4 u! L- j培养条件
, I& c( t5 b! c3 r) ?; w环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
+ |7 v, C  d* \3 I设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
9 z  a, h, q# c3 L  I" C5 j: v3 Q实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 2 n9 o! @. E& j" \' m
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。 1 E7 t, C2 ~# L, Z) b4 _3 O: G
试剂的配制：
' p) [6 _# K- hDMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3 " Z' \  }: e1 `) J+ U
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素
4 A  T' I" F; f9 ~ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子 + e  K; E9 N1 \; r" ]' @
D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红 6 d" \. `- m5 }8 M& f. ^. c1 o& J9 h- N+ v
0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶 - x3 n4 p* T6 K6 t. e% ^
ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO
* d1 l  e. x! N5 m: X  |- _4 SMEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO
8 b% ?! w; q; I3 P9 x- [$ R6 [  DFeeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
+ z! r& F4 i3 T' ^, d/ j丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制 , h1 q. q. o0 z8 w/ f
培养步骤 + k+ u; a; y! n* i
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 & F: F1 I+ t7 O1 D5 C7 v
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
7 b1 u9 o, Z" S- s把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
. K8 f. X  f. n! a: r9 W5 L0 u吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
, _" Q+ ]1 @9 `根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 $ l+ o4 q" X5 B! \. R( k+ \
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 9 E0 R9 h$ F/ d5 T
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 3 s4 |* J. U9 L2 J2 }
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 ! t% q1 {6 e" W, _4 e2 O$ P% j: F
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 & W- g; q( F, Z3 C8 U2 f
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）
1 B+ T- B! N& k) Z一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
* j2 r2 w4 E& u& X% G! b' N小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 / \8 ?, A! Q3 I2 A- h- D; \* \
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
7 ]0 j7 ^" K- r" T把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
/ e3 s/ G; F% l$ k. S& _吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
- P& n! [* p* W$ w- @3 y根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 1 }6 L. B& G5 T% d# I
小鼠胚胎干细胞的传代 7 P; v! a6 f9 V, E+ s, w
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
" [0 J+ v+ `3 O/ v用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
+ C/ M/ l2 }% D1 V* V去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 ( t, n/ W& ]- ?: f
小鼠胚胎干细胞的冻存 ) N$ u* f+ @# Y9 ~3 B
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 9 [  v5 R& Q) F! o
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
* h6 y. r  O) v6 x+ G1 [去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 8 L9 K* H3 [8 p% ]$ u0 T3 G8 J
注意事项
( j9 d6 F& R6 H丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 , z* C6 N. [) ]: H: D* z
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
% p" b0 [, h2 h. o3 F# A$ hES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。 4 A! k7 `1 T6 L0 K2 Q
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。