人胚胎干细胞培养

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人胚胎干细胞培养，共享资料！

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培养条件 & L5 f2 ~8 E* s3 {0 N
环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
$ q5 ]# S2 L# a/ C% H: B6 D. ]设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
' W; e2 S# v2 x实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 5 ]/ _* l" j- b9 u/ T
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
. v8 O, b. e. ?% X. t* ^试剂的配制：
. T6 O% J, u( D8 q9 hDMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3 - k2 f# k3 a6 i; ], H! Y6 W8 u
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素 ' S" ?3 E3 C* H1 o, m* F8 z
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子
5 k0 n/ @! t9 x4 @8 QD-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红 ; }8 o% @3 O; L
0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶
3 q4 c5 B  @& ^+ k9 _( E" u6 i6 yES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO
% n. ?% @' d( W2 s  F2 cMEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO $ j' ]$ j# D( N8 W/ `
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO ; Z( _& N9 {. D" }( c% x
丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制
# ^' K: V4 A$ |9 c6 q: c: m培养步骤 & p- {' `$ b3 Z' n2 J
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。   W& e2 }' X9 k
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
8 _1 |) m% y0 w胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
% b: z' U# f* ?把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
- Q1 M: Z+ e+ ]( j' {8 e/ O吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
) Q; n1 b$ E, d3 k8 \7 ~根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 * N. {) W3 u0 }! e$ V. x
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 ! S7 @' E+ {3 D" j/ U
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 , }. h: x; Q( |  u* G! C( |) L
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 2 l$ T$ Z/ f0 W, r
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
5 P0 v6 ]6 |. T去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 0 N3 k$ [8 t( E7 F% M9 K' G
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 ) m0 X/ |7 G9 Q
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 ( x! p4 u! v* w5 K
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 9 ~/ o) e2 M9 E/ j
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 2 S/ A1 J: B# M7 n6 [
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 8 E$ N5 k& l# l/ ^
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。   M$ K7 i! }; l/ r- v+ o0 E& p. ~
小鼠胚胎干细胞的传代 $ z8 v/ H7 f; w' m
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
4 e" @- F5 h( ~- b用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 9 F4 R3 S2 \- q/ x! ]- a
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
1 P7 L& F' O- U; ?2 U4 O8 \$ Z, ]& ~3 c小鼠胚胎干细胞的冻存 7 \4 {, ~/ V) @( ~
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
) N1 C3 q# _0 _4 |: g用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
9 }$ M; u4 w0 b6 t4 _去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 & i0 \1 m1 \( b% W
注意事项
2 o9 H2 Q% S; q  a% O( D丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 2 o% P* u6 O) Y  u: E; }, m* p9 L0 A
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
- M2 ]% t% p! e' h& {ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
/ s/ U2 A0 m; f6 B" A) B为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

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给的十分详细啊！