人胚胎干细胞培养

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人胚胎干细胞培养，共享资料！

syl82

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培养条件
' e" U* y1 a: O3 V$ g环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
4 e, x2 n9 k; C设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
  v$ J( Z, H1 w& I实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。
% o6 v7 x0 z0 h/ M# G/ ^试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
1 E5 p6 `1 J1 z& x! w试剂的配制： 4 D- U0 ?$ `# \4 k% }2 y0 q
DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3
  }! ~) @) Y# C, |& t. H2 F/ A5 kMEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素 # G7 d: ~5 q9 M- W4 m
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子
$ o1 D8 Y' @1 D# o5 P2 w* g6 A* e* G2 UD-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红
1 g+ F* D" y6 n; D8 v7 \" C8 P0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶 ! i+ N8 _+ ^3 F) G
ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO
: ?8 S: j$ ]' \5 t: B! cMEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO
' s1 v1 n% x! F& f# W! |( o" E7 @Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
6 ^, A9 A/ c: m8 [丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制 & @3 o' Q0 q0 {, t7 M
培养步骤 * n3 c2 S  B$ ~4 \+ M
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
" K7 u7 l# Z! h+ }胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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5 V3 S& w7 C5 U3 s6 }0 r6 K4 ~在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 5 W8 y, J+ C* f! O: Y0 }+ z* Z
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
0 N4 _( b5 G' I3 V$ i9 w吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
) w' r1 A6 o; {1 Y# r( ^4 o7 T根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 / @( g: a9 Y/ d" i
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 ( _& p: v; T; ~/ s* k( L
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 : C" z* `, [2 q! @
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 6 V  u" w+ [1 K- I- E% }. y
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
% K! n; H4 u. z/ O2 O/ @5 W去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） ! \  g7 c( i# [: P$ B
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 8 g0 o7 g" R9 u* z1 h
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
* f" K/ P/ u: u0 {  W在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
# e0 O( _  P' S7 p; ^* C1 S. k把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
. o+ r% v2 m9 N/ _, S吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
7 R/ w: t) ]$ f3 A) k7 Z根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
8 U: K5 H8 c  d% M( U小鼠胚胎干细胞的传代
4 v7 G$ I8 S  A吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
& m% x- P: s7 P用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
. p6 W5 U8 d# u" \8 }去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
) m5 G1 y; ?4 ?0 O小鼠胚胎干细胞的冻存 8 Z$ r( y+ H) n) `
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 * \& y8 [! m! b, m* c
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 & x9 l& q% s& C! m. k! Q' @1 P1 d
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
8 w$ Q4 d& |3 F! l, N/ j注意事项 9 G* |# O7 M4 k- G/ F5 E
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
# o' G/ Z) l9 D- XES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
/ i5 O0 J9 {& g3 k& GES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
3 G+ M. {# t: z3 d* [为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

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给的十分详细啊！