人胚胎干细胞培养

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人胚胎干细胞培养，共享资料！

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培养条件 0 W7 H& _2 ?! _; g
环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。 * i7 |. f; u1 M" W+ p1 ]
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。 2 q& d& u2 N+ \: I8 F4 E0 U& q
实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 - B6 @/ N$ C3 P0 J* B
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。 0 y4 v4 x" c, Z6 u- t- X5 x
试剂的配制： ; d4 z3 N1 N  W; _+ W2 ~$ w; n
DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3 1 w) M+ f1 Q  u# K, l+ {+ ]
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素
" A; Y6 d; b9 q( A+ I& ~- OES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子
8 a, R& g" w! OD-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红
- k- v/ s9 O$ ]8 |0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶 1 T! a8 S! K) Z3 j
ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO
9 b3 E' O! t( JMEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO
; w7 o, w  o, N; X5 \" N3 iFeeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
+ H# j9 P. g$ a  R* A4 t9 ~丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制
, ]+ e6 W3 y; q5 U6 h1 v培养步骤
* l$ x# W* f. b7 g8 S常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 9 F" j, |7 b. M  a! p
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 ) v9 m' c) x4 m5 F) R/ Y) v( K
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 6 L& P- }: Q- R! j" h
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 , I0 K, ~9 V' r9 w
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 2 P) u' N$ }$ ]* m1 E! U! R
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 ' R+ A3 I3 y4 M2 j" s
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
% u5 c$ T- @# Q5 A' z把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
0 T, ^  X% i3 q% m  U2 a把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
: q; Y2 y( u7 t5 b! ~* O$ f+ K, [用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ) R, I" B: V) i
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）
0 \2 m$ L$ d# z- \一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 & L9 T# F$ u2 I8 t  }8 Q4 Z. G
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 " q0 A" ?  [. I3 q5 E
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
2 f$ C7 u1 P: V3 H" i( d5 o把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
: j# i0 Y- z6 y& S吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 - E5 V( X/ C# }3 f" R
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
- x  a, T& J# w* v9 G小鼠胚胎干细胞的传代
$ _. l+ h  T' a3 W/ J$ @8 q吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 2 `% @' I, O- q' O- P* P- H& g
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
1 V$ u6 K4 U5 A( B* ~/ M/ l: O! L去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 1 V, m' \) A8 _5 o/ N
小鼠胚胎干细胞的冻存 * @5 d- o3 x5 Z* N3 ~
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
8 K: {1 a% c* O+ P: e9 ^. c用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
8 z( v, Y' ^! A$ i去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 3 G$ S6 _/ E# l9 Y
注意事项
; X0 ]0 [  p+ t6 u- p9 K" y5 {; @, j丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 9 i$ O- E& E4 o  k; c
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 $ G* m: X! Q1 t; d
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
0 \  N# ?) K0 ^0 X# G5 S为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

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给的十分详细啊！