人胚胎干细胞培养

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人胚胎干细胞培养，共享资料！

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给的十分详细啊！

syl82

7 u, ^  I! e5 G& n- a- P7 o% T8 B' @
培养条件 9 ]: k9 a! F2 f& D: F
环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。 6 Y) N3 i. H9 S' m
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。 + c1 b2 j& S: I2 P
实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 " A! Y! j; a# W& l7 N* S
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
( ]. N; q, o' k试剂的配制： + v% d5 v( y# z2 a8 {
DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3
0 }2 B2 g  X# d% YMEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素
. a5 y7 Z7 Z/ I) v# PES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子
# {2 T6 B: b$ l5 g3 pD-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红
. _3 B1 a( t" f% W; x0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶
- r. z8 v& m7 }% ]8 |2 dES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO 8 g& P9 P3 |& d7 c: ]& X* M, M* D
MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO & g3 C& x* f7 w, S
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
0 X- p+ z+ R4 d) G% M# R$ }+ S丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制 7 v( ~5 P% P6 w0 f+ ^% F& W% x9 F
培养步骤
% I! M1 ]" ?  y常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 & o( z1 S4 W- D2 r0 p4 X1 T6 J+ s/ W

( T$ R- M' _. ]. l' y! R小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
) G0 q- H" V. v, K- c# S8 W+ S" [胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 ( T' ?& O! f: ?; t* E

1 u, i5 w5 r5 @5 C  v2 z( O在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
0 L; i: [% s* f3 n$ `, I- ?, J4 z7 z把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
* f5 f( Z3 C3 f# s9 L吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
6 }7 ^  I6 d" m. T9 A. m根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。   o2 k4 {# m4 S- I: _
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
7 x' f3 U/ w8 I把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 8 C7 W) O& Z5 r' L7 a  h/ D  T0 g* K
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 0 w. q6 ^- Z" b; c' Q+ l
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ! d) ~& {& v$ a# ?' i% `
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 2 j5 k3 z2 D1 O+ Q$ B1 d, z3 x
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
, }  U! @3 J6 h小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
6 r8 X5 P! f4 h+ a9 D6 V" S2 J6 O$ O在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
9 P0 A3 N7 D' R8 V. F# h3 q, }把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 $ `$ e7 a4 s: a) ?8 g
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 . p( y$ V9 H0 W8 p* \. A- E
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 ! ~5 Z3 E/ H, m; {3 C
小鼠胚胎干细胞的传代
4 Y. [/ V! N9 r( x- u吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
0 Z/ S5 ]* K1 P/ a用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
1 v2 n/ ?3 F; ^  e  R& v* a% Z去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 + y* P" s) q2 ?& A: d3 M
小鼠胚胎干细胞的冻存 $ r, Y% a( n! ]# R. t% x6 d- k6 R
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
7 d: a/ ~8 Z8 N* U) o9 `2 S# r用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
1 a) [# Q' M" o. U: s, [# T0 x/ ]去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。   C& O1 g0 K6 X8 q9 f
注意事项 " Z; K3 Q* s" ^6 q$ |2 W) B% `4 h
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 " z4 M, A- K. V% m- _: O" n& A- ^' Q
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 & F3 N9 z, L9 X. ^/ s
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
+ H- W2 A  d; z, E0 G  H为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。