人胚胎干细胞培养

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人胚胎干细胞培养，共享资料！

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" m6 V" [* U4 ~
+ {* ]& h5 }& x6 B1 k, R5 ~2 G培养条件
* A$ |3 l, \) I9 D5 H环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。 1 ~- C* D, S' ^
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。 0 t. A) W% m; W: D
实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 ; y6 X8 O9 V# ~# K# m9 k
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
3 N! x* ]* ^4 g8 g7 X9 D& \试剂的配制： 3 _- C( ^* m. y0 w" A0 T* e; s# w
DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3
* [/ ^. I& g+ V6 @8 i! {MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素
. N8 B4 G$ @9 X/ i+ O: SES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子 - x* ?8 O6 U; N+ s% }9 ~2 e; L
D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红
0 A5 [3 `& P4 b4 q% x7 j0 j2 g0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶
3 }* v4 [% R( @) Y. S8 @- g% L7 A/ rES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO ' z- j2 o' y! V7 d0 L' I9 s6 Z1 ]
MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO   R% j2 F1 z4 @
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
; E$ m  _9 i0 ?& F) C丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制   e" `/ I( Y# |8 B6 v4 r
培养步骤 3 {8 Z5 C/ o5 `: n
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 8 [6 p0 \2 X) O( U; g. V
; v, ~1 Q" Z0 o5 x% W& B5 M
小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 2 f% s- T# D' z& d" A
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
+ J- t0 I; A- _9 U$ z把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 $ b- @0 |6 w; \' G; k, I$ o+ v
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
+ |4 d5 L4 g3 u& |根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
/ X& Y  \5 }" }( e滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
; b0 T$ \9 @2 F( C6 r3 p把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 . V0 p$ D% i9 w  K& ^
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
; a. V+ X. v7 I& G+ T. H8 r7 s用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ( A  I) l% t: ^, U/ T* I
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）
" n1 p1 w) o: @* _( l- f一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
% }2 M$ \6 I1 j( c9 V/ Y& t+ C小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 2 y& ]; u2 C6 C( U3 A) n2 i4 q
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 5 c/ t* h0 S, W6 D, t9 _+ x
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 3 r& ~8 k: D% k8 l
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
" H5 P' D+ i2 I9 [& \! C  S  [, @根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
! m/ ?8 d+ a6 G小鼠胚胎干细胞的传代
2 q0 T2 ]; Y. |7 v! A吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 0 S4 i9 v! u; b# @  D% H
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。   Q7 k2 L0 m2 G
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 # W- ^% H/ d+ R: D& ~* _
小鼠胚胎干细胞的冻存
2 F* ~3 l+ Q0 ~& u8 J3 s吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 ; P, U0 \6 h9 F% I* s' }
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 , P: T( Y0 O* e7 o
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
7 F; T% |' N- s; x2 a注意事项
5 O3 }& a4 {4 @# V9 A9 @丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 $ r4 b& A+ I  G6 S6 ?% }; z3 V/ M
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 ; W3 G6 m- s5 Y7 u- Z& `& m' d$ s
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。 4 j: Z/ s- ^. A/ b4 |; }
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

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给的十分详细啊！