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作者：蒋传路作者单位：哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150086 $ q4 y) X) B; n/ z1 B$ V3 O. B
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$ h \9 }! C ] m3 H+ R 【摘要】 目的 探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类雪旺细胞各阶段的标志物表达情况。 方法 分别提取、分离和纯化Wistar鼠骨髓间充质干细胞做为待诱导细胞。诱导试剂为2-巯基乙醇、全反式维甲酸、heregulin-β1、血小板源性生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和弗司扣林。控制诱导试剂加入的种类，使细胞处于不同的诱导阶段，将其分为5组分别行免疫组化检测细胞p75、s-100和GFAP的表达情况。第1组未加入任何诱导试剂。第2组经过2-巯基乙醇诱导。第3组经过2-巯基乙醇诱导后，再加入全反式维甲酸。第4组在第3组基础上，再同时加入heregulin-β1、血小板源性生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和弗司扣林。第5组是将第4组细胞移入普通培养基培养7 d后进行检测。 结果 第1~3组标志物p75、s-100、GFAP表达率均为阴性，第4组p75 （59.0 ± 4.1）%、s-100 （62.0 ± 5.4）% 和GFAP （56.0 ± 3.2）%，第5组p75 （34.0 ± 5.2）%、s-100 （23.0 ± 2.5）% 和GFAP （32.0 ± 4.8）%。 结论 骨髓间充质干细胞在序贯加入诱导因子后可分化为类雪旺细胞，但类雪旺细胞表达雪旺细胞的标志物不具有持续性。 ' R6 W% m P( S0 W H9 l
【关键词】骨髓间充质干细胞 细胞分化 雪旺细胞 免疫组织化学
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JIANG Chuanlu, ZHANG Junhe0 e% i8 U ~7 Q8 g
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Department of Neurosurgery, the Second Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China;Department of Neurosurgery, Heilongjiang Province Nangang Hospital, Harbin 150001, China& G Z+ b' V, v+ q+ t
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Abstract:ObjectiveTo explore the expression of the cell markers at the various stages in vitro inducing differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) into Schwann-like cell in Wistar rats.MethodsThe Wistar rat's BMSCs were extracted, separated and purified and then used as to be induced cells. 2-mercaptoethanol, all-trans retinoic acid (ATRA), heregulin-β1, PDGF-BB, b-FGF and forskolin were used as induction agent. The cells were divided into 5 groups and investigated in different induction periods by controlling the species of agent. Non-induced cells belonged to group 1. Cells induced by 2-mercaptoethanol belonged to group 2. Cells induced by both 2-mercaptoethanol and ATRA belonged to group 3. Based on the group 3, heregulin-β1, PDGF-BB, b-FGF and forskolin were added in the group 4. The cells in group 4 were cultured in 10% FBS and DMEM for 7 d, and then called group 5. The positive percentages of p75, s-100 and GFAP expression of the cells were measured by immunohistochemical methods.ResultsThe cultured cells negatively expressed p75, s-100 and GFAP in groups 1, 2 and 3. The positive expression rates for the three cell markers were (59.0±4.1)% for p75, (62.0±5.4)% for s-100, and (56.0±3.2)% for GFAP in group 4, and (34.0±5.2)% for p75, (23.0±2.5)% for s-100, and (32.0±4.8)% for GFAP in group 5.ConclusionBMSCs can be induced into Schwann-like cells in the culture medium into which the inducing factors are added in a proper order, but the Schwann-like cell's expression for the marker is not continuous.6 X; ^+ m& {$ T9 W# B# \+ v
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Key words:bone marrow stromal cells;cell differentiation;schwann cell;immunohistochemistry
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骨髓间充质干细胞处于特定微环境时，可表达骨、软骨、肌肉、神经元和神经胶质等细胞表型。实验证明：分化为雪旺细胞的骨髓间充质干细胞可表达p75、s-100 和GFAP[1]。由于诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的具体机制尚未清楚，因此，研究处于不同诱导阶段的骨髓间充质干细胞标志物的表达情况，有助于进一步探讨其诱导分化机制。
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/ N+ g* q+ Y l' r 1 材料与方法0 F0 M* s+ r2 T/ q0 j
. I* B/ G% M e$ W q, y9 g 1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠25只。年龄8~12 d，体质量35~70 g，由哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供。0 ~! e$ E# T4 J
) C5 q1 D% F8 s# @; v 1.2 主要试剂 优级胎牛血清 （FBS，TBD公司），DMEM （Hyclone公司），胰蛋白酶 （Sigma公司），全反式维甲酸 （ATRA，Sigma公司），2-巯基乙醇 （Amresco公司），福斯高林 （Forskolin，Alexis公司），碱性成纤维细胞生长因子 （b-FGF，Peprotech公司），血小板源性生长因子 （PDGF-BB，peprotech公司），heregulin- β1 （Sigma公司），兔抗鼠神经胶质酸性蛋白 （GFAP） 多克隆抗体，兔抗鼠s-100蛋白多克隆抗体，兔抗鼠p75多克隆抗体 （博士德公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔PV6001试剂盒 （中杉公司）' K k' b% \" @
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1.3 骨髓间充质干细胞的分离和培养 将Wistar大鼠溺毙于75%乙醇中，浸泡10 min。分离四肢长骨，截断其与躯干的连接。剥净表面残留软组织，放入200 U的抗生素溶液 （含青、链霉素） 中浸泡5 min。以PBS冲洗后切去干骺端少量骨质，5 ml注射器抽取含100 U肝素的生理盐水冲洗骨髓腔，冲洗液移入10 ml离心管中，1 000 r/min离心8 min，弃上清。加入含10% FBS的DMEM培养液，吹打均匀，移入培养瓶。镜下观察后移入37 ℃﹑5%CO2饱和湿度的孵育箱中。3 d后换液，换液1次/d，连续培养，利用骨髓间充质干细胞贴壁特性清除杂细胞，当贴壁细胞近70%~80%融合时消化，转入预置Nunc膜片的24孔板中，准备诱导分化 （图1A）。
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1.4 骨髓间充质干细胞向雪旺细胞的诱导和分化25只Wistar大鼠随机分为5组，每组5只，分别提取﹑分离和纯化骨髓间充质干细胞培养。第1组细胞仅用含10% FBS的DMEM培养。第2组细胞以PBS冲洗后加入含1 mmol/L 2-巯基乙醇的DMEM培养液中孵育24 h。第3组在第2组基础上PBS冲洗后加入含35 ng/ml ATRA、10% FBS的DMEM培养液中孵育3 d，中间换液2次。第4组在第3组基础上PBS冲洗后加入含10% FBS及各种因子的DMEM培养液 （heregulin-β1 200 ng/ml﹑PDGF-BB 10 ng/ml﹑b-FGF 5 ng/ml和Forskolin 5 μmol/L），换相同培养液1次/2 d，连续孵育7 d （图1B）。第5组在第4组基础上PBS冲洗后加入含10% FBS的DMEM培养液，换液1次/2 d，连续7 d。5 |% ]. n0 j2 M; }: E
$ z f& ?# Z5 [0 P8 @ 1.5 免疫组化检测表面标志物的表达 将各阶段选取的6张细胞贴壁膜片以PBS冲洗，稍晾干，以4 ℃丙酮固定5 min。3% H2O2孵育5 min，阻断内源性过氧化物酶。滴加兔抗鼠GFAP多克隆抗体 （1 ∶ 100）、兔抗鼠s-100蛋白多克隆抗体 （1 ∶ 100）、兔抗鼠p75多克隆抗体 （1 ∶ 100），4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗5 min。滴加标记物为HRP的山羊抗兔IgG抗体，室温孵育20 min，PBS冲洗5 min。s-100和GFAP指标检测选用DAB显色。蒸馏水充分冲洗。苏木精淡染，脱水后封片 （图2A、2B）。p75指标选用AEC显色 （图2C）。镜下随机选取10个视野，计数100个细胞，s-100和GFAP阳性细胞的细胞质为棕色，p75阳性细胞的细胞膜为红色。计算各阶段的标记物表达阳性率的平均值。
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1.6统计学分析采用SAS统计软件进行统计分析，对同一指标组间阳性率比较采用t检验。. C- B6 S' ~' ~
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2 结果
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$ w5 [& F9 D7 Z% K7 k 第1~3组标志物p75、s－100、GFAP表达均为阴性；第4组标志物表达阳性率分别为 （59.0 ± 4.1）%、（62.0 ± 5.4）%和 （56.0 ± 3.2）%；第5组则分别为 （34.0 ± 5.2）%、（23.0 ± 2.5）%和 （32.0 ± 4.8）%。第4组与第5组间同一指标阳性率比较，差异具有统计学意义 （P ＜0.05）。
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3.1骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞对周围神经损伤修复的意义由于成年哺乳动物神经元缺乏再生能力，中枢神经损伤后很难再生，周围神经虽存在一定再生能力，但影响因素很多。雪旺细胞在周围神经再生过程中发挥着决定性作用，其作用机制包括分泌多种神经营养因子和细胞外基质，表达黏附分子，引导轴突再生等[2]。已有研究证实：利用雪旺细胞作为种子细胞实现轴索延伸完成神经再生，是切实可行的。由于周围基质的不同，周围神经的再生能力也不同。这说明神经再生不仅取决于细胞本身，还与雪旺细胞与周围基质的相互作用有关[3]。虽然雪旺细胞是修复周围神经损伤最理想的种子细胞，但其本身是一种终末期细胞，体外培养缺乏良好的增殖能力，很难达到移植所需的理想浓度；且自体取材易造成新的损伤。虽然现阶段已通过基因修饰技术得到了雪旺细胞的永生株，但其分泌功能也随之降低，对神经再生的有效性显著下降。Cuevas等[4]将骨髓间充质干细胞直接植入神经断端，经过一段时间后通过检测植入骨髓间充质干细胞发现：其表达雪旺细胞的表型，且具有明显神经再生迹象。同时，相关实验证实：骨髓基质细胞分泌的IL-6具有确定的促神经再生的作用。检测体外诱导骨髓间充质干细胞移入普通培养液后的表面标志物的稳定问题，不仅证实了转化的可能性，且可进一步探讨发挥作用的细胞类型。随着组织工程学研究的广泛深入，利用骨髓间充质干细胞作为种子细胞修复周围神经损伤，越来越显现出其优越性。0 j! n6 w, L( N$ B
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3.2骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞表面标志物表达的稳定问题Tremain等[5]对骨髓间充质干细胞进行微序列研究发现：细胞表达基因超过2 000种，其中许多基因与间充质细胞系无关。可见骨髓间充质干细胞不仅可以向间充质细胞系分化，而且可向其他细胞系分化。本实验中作为雪旺细胞相对特异性标志物的p75、s-100、GFAP在第1组表达均为阴性。据Dezawa等[6]报告，s-100表达有一定的阳性率；国内文献阳性率约为5%。p75和GFAP的表达为阴性，与文献报告相符。已有的实验证实：在不同的刺激因子作用下，骨髓间充质干细胞的相关基因可被启动，从而有相关蛋白的表达[7]。本实验2、3组标志物p75，s-100、GFAP表达呈阴性，该结果可通过诱导剂的作用进行解释：2-巯基乙醇不仅可诱导骨髓间充质干细胞处于原始状态，而且具有促使骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的趋势[8]。ArRA可与其他细胞因子结合，将骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞；同时是一种强诱导分化剂，可影响被诱导细胞表面蛋白和受体的表达，在体内对神经系统的发生和发育具有重要的影响[9-10]。骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞阶段性的特点决定了第2~3组细胞不表达标志物p75、s-100、GFAP。Forskolin除可以增加细胞内cAMP的水平外，还与heregulin-β1共同具有使骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化的作用[11]。b-FGF的作用是促进中胚层和外胚层来源细胞的增殖与分化，促进细胞外基质蛋白的分泌[12]。本实验第4组中可见p75、s-100、GFAP表达均有一定的阳性率，进一步验证了骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞阶段性的特点及转分化的可能性。在以上因子序贯作用下，骨髓间充质干细胞被诱导分化为雪旺细胞。雪旺细胞是一种终末期细胞，相对来说具有很好的稳定性。本实验中第5组可见标志物p75、s-100、GFAP表达阳性率明显下降，其最大的可能性是转分化后的雪旺细胞不具有稳定性。但第5组细胞在培养过程中仍具有一定的增殖能力，阳性率下降不除外非阳性细胞所占比例增加造成。此外，培养过程中可见漂浮细胞，其原因有待进一步研究。" N' T' K7 E$ R& `
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/ c5 |6 \0 M* V0 {7 C1 c, ` 骨髓间充质干细胞取材于自体，不涉及伦理问题，现阶段实验尚未证明其致畸性，随着研究的深入，其应用范围必将更加广泛。9 P! a( I' u3 }1 f% _
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