肿瘤原代培养分选干细胞及成球实验的系列问题

caipan1982

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  看了一些资料及参考了一下各位的经验，但还是有些问题不是那么了然，现总结一下，望各位不吝赐教，多批评指正。
9 U2 w! |+ v5 I2 e9 c0 Z# {% ]! W     一、肿瘤组织中获取原代细胞
4 @. g0 `" {$ y5 e    1、剁碎组织，胶原酶消化1-2小时，（也可同时加透明质酸酶），过滤细胞。
2 ?: y; P$ @( `5 w7 q: N问题：（1）过滤细胞时间的选择：   是先消化还是先过滤好？
& _! N3 r* p! q1 B             据本人对原代细胞培养的经验，经过以上方法获得的原代细胞不是很多，甚至还有很多不是肿瘤细胞。    而且我感觉这些生存下来的贴壁细胞大部分是通过未被消化掉的残存组织块中长出来的，而不是消化后悬浮的细胞贴壁。   如果是这种情况的话，经过机械分离，胶原酶消化，过滤的一系列程序后应该剩不了多少细胞了，过筛孔的应该还有大量的细胞碎片和死细胞。怎么去除？也有说用密度梯度离心来去除死细胞的?请问这是什么方法？？      这么少、这么弱的细胞怎么能去做分选呢？ 焦虑！！！
) [1 G( O- N- M) D2 }            （2）有人用透明质酸酶么？ 我看老外用，论坛也有人建议用，于是买了默克的，却发现公司根本就不提供建议使用剂量。所以请教各位分享点经验。怎么使用？？？
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    二、关于贴壁细胞的成球实验% N+ s( `' i& g7 v- d3 j
           目前看老外都是按上面的方法直接分选干细胞放在无血清培养基、超低粘附培养皿中进行培养，但也有很多人也用细胞系做。所以请教一下如何诱导贴壁细胞的成球。
4 z: U" q/ ~! }       问题：（1）一般选择多大的培养皿，6孔板？6 ~; y: U! r4 i0 d6 r+ L
                  （2）接种密度？10000~100000个/ml还是说这个都要靠自己去摸索？有没参考密度？
3 ]% c8 }. |' U9 ^                  （3）怎么换液？
' Z8 `: i. Z9 Z0 k             A  看老外只是说一周加两次生长因子，我想那么高密度的细胞经过无血清培养肯定死一大片，这些死细胞不处理？   
* k8 }6 Z- j8 Z, e             B  也有说人说直接添加培养基，营养是在一定程度上保证了但是仍然解决不了死细胞“污染”干细胞生存环境的问题。      : d9 W) V" Z) p; Q
             C 也有说离心换液的，如果离心的话那还得再次吹打使细胞散开。这岂不是影响成球？？ 好不容易成了一点球被吹散了，又得从头再来？     纠结？？？   
$ j" T$ H1 I# O+ q             D另外致密球和疏松球有什么分别，疏松球是不是假肿瘤干细胞细胞球，只是细胞的机械粘附？？？6 ]2 l* k8 I  Z) e
             E一旦成球后需要消化传代，请问现在大家都用哪种酶？    有用胰酶的也有用invitrogen的asscuate的，哪种好用？( H1 |3 p" [' G% Q, f
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            （4 ）据老外的文献，有将细胞进行克隆密度培养的，那是不是也可以将细胞房子96孔板中培养，观察单个细胞的成球能力呢？
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                      问题比较多？谢谢大家慢慢指教