关于ES细胞培养液的pH问题

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% _- e/ }5 U2 {8 N; i常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
; M7 m! v* t+ N8 L$ t9 R胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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7 n- Q& s: z  B, U* `在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
2 x; K* D# M  _# `5 R$ u把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 4 b0 X5 X3 ?) J9 V( @3 O  M# M$ T. {
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 2 a% l6 f7 ?8 M8 Y
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 , T1 t2 E; v4 G, a6 n1 j
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 + ]2 u( o  ~% c- i8 J& ?0 P  |
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
3 O1 H% F3 e0 k/ u把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 # l" Z! ^- O$ l# F+ B' a* O' s3 C0 t
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 7 I7 W- `% I7 G) b, K6 \
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 5 L/ u+ e7 `* V, Z  S8 C. a6 b1 F
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
+ b  O! I0 j2 H6 s# U小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 ( V  b5 ~3 H7 p. E! M% a
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
+ ^+ z: x9 P+ O% j2 G: @把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 # h- v( i* a& H4 u8 H
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
* Q; t# {  @- r9 ]" G# C: u根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 * L' x: e: N3 j% k
小鼠胚胎干细胞的传代
+ z$ O* B% j+ O$ Y# u" B吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 " `6 S- P  \3 S* x& e6 g
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
! U( G! m1 c( Q+ i8 K4 Q去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 - }1 E; |% \5 z4 I
小鼠胚胎干细胞的冻存 0 w2 z# [- l# ?6 \) I! z# {
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 ' O0 T0 B# g9 A3 D0 N2 _& ]
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 2 C% a) I& K/ ]& ^  h
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
! J5 Z# Q3 g2 Z# i注意事项 # b- G$ q, @& w
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
9 q% s! V$ X- ]/ M* kES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 & P, n# E1 E1 W& P
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
' D9 C9 {; n& C2 V! S5 A: L4 ^为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。