关于ES细胞培养液的pH问题

carolshen

在文献中，基本上没有提过这个问题，想请问下这里的朋友们，请问你们在培养ES细胞时，考虑了培养液的pH吗？

hyde

请教各种细胞培养基的颜色+ P8 w) C3 N% m/ W" l: }; X
http://www.stemcell8.cn/thread-25937-1-1.html" L7 V. ^$ J+ A. F0 n) v

痞子的烟头

以前我们实验室用的都是买的培养基DF12，其它的直接加上就可以用，没有测试PH，但是如果是自己的配，必须要测试！

上海过客

新配出来的 培养基是亮黄色 。 加进去过一段时间 后变红色 。 再变成黄色 就不能用了 。2 q) J/ A& q1 l8 J* m, n( l
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carolshen

呃，不好意思，谢谢大家的关注！: Y: \  I! X. Q# |
忘说明一下，我用的是条件培养基，就是制完conditioned medium之后，你们还有调节pH吗？

heather_lu

一般不调

syl82

3 k% l) \, v. ~( C- d: q! |! U2 Z2 c! e1 ]8 k9 X/ L" j. l
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
; s2 r/ o0 f. v/ F0 a7 ^胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 3 N( K2 o% g6 S5 d* x
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 9 X  z* c- e* w# f
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 * E& Q/ |* u: S0 }, z
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 8 j) J# W. H8 i
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 ! Q( y7 q: |" ?4 l- H
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
/ Q- f7 {1 X! t0 |1 r* h把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 ! `  {/ O9 i5 `/ B
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 , a" V8 |. F, ]/ J8 w
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） % J/ U% B! X% F( r- J
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 0 t1 N8 ^0 a$ u2 I% ~9 j6 H
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
. r! v4 i9 l3 D8 g0 }在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
/ l$ i8 x7 K- v- T把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 ) u! G) b4 {+ p2 j2 ^+ t
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 4 b; |9 ]. k3 c3 E
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 ) ^! \+ K6 m2 |/ k0 H% V  o. I6 [) R
小鼠胚胎干细胞的传代
6 f) Q/ I- E( b5 t  g吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 " d* F1 D" f- N% x$ G7 @+ U8 o# w
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 $ }3 X" s1 F" A3 A9 n8 P
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
" G- v, a! @+ X3 q0 p3 h小鼠胚胎干细胞的冻存 0 L- j1 C% h0 H0 V" w
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
: ?: C# u0 z. V/ u用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 " p5 T- B& i# x" q1 E
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
4 j+ G# l0 k" J: W. ~$ C注意事项 0 @, F, q8 J3 u6 j% G
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
. M  T+ E( Y' x9 ?9 H- x  |ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 " O. M* i/ ^9 d% f3 K+ P
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
% G3 E9 E5 u7 `2 j! |5 L- I为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。