关于ES细胞培养液的pH问题

carolshen

在文献中，基本上没有提过这个问题，想请问下这里的朋友们，请问你们在培养ES细胞时，考虑了培养液的pH吗？

hyde

请教各种细胞培养基的颜色
6 J; o3 H" ^3 h3 o1 F6 e( khttp://www.stemcell8.cn/thread-25937-1-1.html
3 q( c3 N/ g: n

痞子的烟头

以前我们实验室用的都是买的培养基DF12，其它的直接加上就可以用，没有测试PH，但是如果是自己的配，必须要测试！

上海过客

新配出来的 培养基是亮黄色 。 加进去过一段时间 后变红色 。 再变成黄色 就不能用了 。+ ]8 k$ Y- v* r( K( s  W. U* z/ a

9 e& X" O: O* _  Q; M8 J& S9 s

carolshen

呃，不好意思，谢谢大家的关注！
% E3 g# I0 e2 _3 U忘说明一下，我用的是条件培养基，就是制完conditioned medium之后，你们还有调节pH吗？

heather_lu

一般不调

syl82

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5 j" x; P" X/ Y常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 + ]5 P# M% \  f& ^# s# ?  c

) A2 X! o3 T* }; Y4 E, b小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 0 p' _; ]* [; ]' y) j9 F# e% T) c
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 ! W5 n7 b3 q! U0 F4 Q9 |6 I4 L1 Q' z. N
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
. K" [6 v1 _8 Q把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
0 _& O# l, ]* R7 m( m0 R% Q吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 , t7 Y3 R7 I: x0 ]
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
; {/ H1 p) I$ m4 E滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 * n9 O) I3 x, m
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
' f- j8 D* w* `3 F' Y) ~把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 * q+ R1 P# f' M, X
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ' ~, T1 E# V5 g. z; M! e: }0 J
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）   T$ b3 D) I. a( o' V
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 , Q. l1 n% l$ q$ Z( @/ }" W
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 3 E/ d' ~' M' x2 Z7 f
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 $ u" n7 n- U0 l6 L. I9 N& z
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 # ]! c6 W0 I* W& w& M
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 - n! R# u- P( T3 m( B) z1 Z
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 6 Z, v  z; u" F
小鼠胚胎干细胞的传代
4 o; K8 I2 W1 [' x( B  x吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 * R. q* W0 e! j/ Y0 B, h
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 : o6 f  @/ A9 O  u% r4 e" O
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 # |$ z, h" l$ ?' F6 ^
小鼠胚胎干细胞的冻存
& O: R4 ]" ]- _吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
$ A8 E' j. k% y  J" Q( i用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
6 N7 ^2 u, U2 F3 {. z. {5 u5 ]* M去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 % v, u; B7 Q& H' }
注意事项
9 Y& @+ M8 ~$ G8 o. Q丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
; y' A  ]9 w8 G; ^" S: sES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
# U5 g; q( B5 ~ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
* W0 g: \/ `7 b* ~5 e! O为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。