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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:31 编辑
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常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 % T2 s6 [" ^" k8 P+ o
" G7 H+ U# _ B/ G1 a9 t小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
. G/ J7 M, H2 D; |& c# |胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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8 \: b8 I3 \. ?; L! D在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
1 Y. {- V& B" e9 n把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
) P0 c# i( p7 O+ x5 n( n+ h吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 ) i+ c! d1 `, q) |7 M
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 N" x, }# }. d. n& e4 s- Y+ y. v
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 ( N- Y! z2 M0 u+ M
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 6 m& b0 u" P' z
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 , ]6 L$ l* f$ M& e6 @/ I
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 9 {! A8 H1 M O- T
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） " U/ ^4 ~6 x9 m7 O
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 - \. ^& r9 R7 X
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
3 o+ ?1 L# |: ^3 c Y8 f9 C$ Y% Q在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
$ H4 G% ~# C$ j! q1 ]- I把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 9 ^5 Z) v5 n, f9 o/ L6 b
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
" v/ ~$ ~9 ]% c$ @4 X" @( D根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
. ~2 J" U- l+ ~6 C0 U9 z小鼠胚胎干细胞的传代
, A' D1 Q' L6 ]8 f1 o6 H吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 : y" G, G5 z) [' J* ^
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 6 g1 m0 h1 |5 I$ g5 Q
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 7 B4 A$ t5 A/ K: G, C
小鼠胚胎干细胞的冻存 & Z9 w2 r8 B' C: U( G
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
5 u( g- e- b5 i4 e用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
1 W* I' }9 o" ]9 B" w9 I去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 # O; e8 e3 Q0 t3 W
注意事项
1 c7 W/ g# E/ D6 F丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
& z# z2 \5 e, B2 ~8 J, b/ s+ l! |ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
+ B( m5 H- g4 @+ yES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
. K) Z) C* z7 n( k5 F7 {8 y1 h为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。 |
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发表于 2010-12-27 14:35
发表于 2010-12-27 15:43
