关于ES细胞培养液的pH问题

carolshen

在文献中，基本上没有提过这个问题，想请问下这里的朋友们，请问你们在培养ES细胞时，考虑了培养液的pH吗？

hyde

请教各种细胞培养基的颜色
0 f& C5 h+ w+ a) K% V( u* chttp://www.stemcell8.cn/thread-25937-1-1.html6 C  R: N+ u* K% Y

痞子的烟头

以前我们实验室用的都是买的培养基DF12，其它的直接加上就可以用，没有测试PH，但是如果是自己的配，必须要测试！

上海过客

新配出来的 培养基是亮黄色 。 加进去过一段时间 后变红色 。 再变成黄色 就不能用了 。
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carolshen

呃，不好意思，谢谢大家的关注！
( \& J/ p: O9 ]! D0 l  O* n6 J忘说明一下，我用的是条件培养基，就是制完conditioned medium之后，你们还有调节pH吗？

heather_lu

一般不调

syl82

: X. ]7 ~- `2 Q9 i" L
4 S% s4 N! B# Z0 T% ]' R; w常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
! A  L9 [9 S3 ?5 C1 j胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 % J# J5 \( S3 T, ]4 c1 n# D
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
) V5 _1 M2 c' M5 W% j! a+ [吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 * O5 W' h' M. t
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
& X: `( p- V3 m( i* ]6 D滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
/ D* ]4 K( p# V, }9 w把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
3 f: v. m# `- N. q+ V把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
2 g7 R% u9 ^! k' t7 c- K" X用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
0 K" p3 X0 |  ^* V5 n; C  i5 T去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 5 ~0 ]7 ]- |- t2 ^& b5 x" F% F
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
" K& B1 X- ]- f+ l小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 3 u7 q  O4 O3 M$ C1 ]2 d
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
. L( }% Y: w) a# B) r4 A3 r把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 3 U3 ^5 q1 \" k
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 ! h: b7 X/ U5 L+ y: ^
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 ( \7 R: f$ u- B$ ]
小鼠胚胎干细胞的传代 " t' ^6 F7 \+ `2 ^! G( n
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 ) I- N4 Q  y0 q. u! {
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
, C6 I, ?( C$ H- G) Q. U  K去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 & C6 S& m! a4 l( \+ z
小鼠胚胎干细胞的冻存 $ \+ L2 P) \% Y* ]+ c" H( B: l
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 * K" D2 L7 F: q" r5 c% W6 e+ N. R
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
7 }2 t+ M/ X* a' O; Z# p8 K去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
- A) K! H- N, [* Z$ t注意事项 9 Z( R& b1 @) \" [
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 : [# D  U# C/ x: ^- m) }
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
1 f9 E( T4 V, @" ^* PES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。 8 @- B! u' q: ?3 f* {  |
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。