RT-PCR with gemome or cDNA

chleiwu

2010-12-31 16:29 上传

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RT-PCR

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前三个样模板为cDNA, 四样为基因组，5样为空对照，共用跨5000bp内含子的引物，结果如上图，cDNA扩出来目的条带，而基因组却扩出来一条比目的基因更小的条带，这是为什么呢？如何用primers 或者 目的cDNA序列做Blast?7 T! _1 B& S1 C% `% z) F6 H

frank110

你用基因组作为模板扩增的，应该是非特异性扩增。如果说这几管PCR是用一个程序扩增的话，你考虑一下你的延伸时间对不对，因为基因组中有内含子的存在。primers 或者 目的cDNA序列做Blast可以再NCBI中做，主页面中就有Blast的图标，点击进去，输入序列就可以，很easy的。

hcluo

如果你不是很确信带的真实性，我的建议就是，将带回收了就行测序。然后进行序列对比分析，应该就可以确认了。

chleiwu

回复 hcluo 的帖子
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3 [9 [" }7 ]! r% K& u谢谢

l123w456x789

引物设计没错的话，基因组扩的肯定是非特异条带，内含子一般比较大，加上你的目的基因，同样的条件下，肯定扩增不出来的，至少延伸时间就不够，把CDNA条带回收后测个序就可以了。

l123w456x789

对了 你说你跨的是5000BP，肯定阔不出来的，这么长片段，正常情况下，用普通TAQ酶也难扩

siyue13

5000BP的话，用一些高端的taq还是能做的，不过，说真的，测序一个吧，很简单

janeyu

可能是引物的特异性不是很好，去NCBI中的primer blast检测下你的引物的特异性。有必要的话重新设计一条引物。

chleiwu

回复 janeyu 的帖子& J" ?/ x" m6 e. ~' B. |7 Z3 S

2 s% h2 q9 t5 P' P: P2 W0 J9 m2 Mthanks