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发表于 2011-1-4 19:41 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

本帖最后由 like_gj 于 2011-1-4 19:48 编辑
, N/ c! {1 v$ R0 U
唉不容易呀我是找了好久希望能对大家有用& X- @3 _" W& a. d& D
实在抱歉不会添加附件  大家将就看吧4 o" K2 y; u3 R* C! W, V( |$ q
+ C+ q7 [4 I4 z8 r+ l
分子生物学常用实验技术: `) G# Y: h/ M% d& e: W2 I. G
第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定
第二章 DNA 酶切及凝胶电泳
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第四章 RNA 的提取和cDNA 合成$ i5 X" [& F3 ^8 E* a
第五章重组质粒的连接、转化及筛选4 k5 |) h5 l4 L+ c# ]2 ^
第六章基因组 DNA 的提取5 O: N8 Y3 I1 V8 z0 `# E+ ^
第七章 RFLP 和RAPD 技术
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
第九章分子杂交技术5 x8 K. X& Z% O8 `# a1 K, e/ z8 ]
第十章测序技术$ L+ }2 ]8 I) Z1 L; r
第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定
第一节概述
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体
(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb 不等,为双链、闭环的DNA 分子,
并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和( ]' W2 o6 m( y# _
转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于7 h: |0 L6 `6 {% I
宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F 质粒(又称F 因子或性质粒)、R 质粒
(抗药性因子)和Col 质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。4 S# ?6 ^# {) _; w; o! M  k' t
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed
control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内
只含有1 个或几个质粒分子,如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有
许多拷贝,一般在20 个以上,如Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、' X, h# R  U$ m% E3 a
染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可
由原来20 多个扩增至1000-3000 个,此时质粒DNA 占总DNA 的含量可由原来的2%增加至40-50%。/ e. ^/ v+ w( G" p% c3 E8 X0 d
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,
它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞, g8 o3 p$ V% g
中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒" R4 ~8 ^9 O! r% U; n& x& T  p
的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共
存于同一宿主细胞中。
质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生
大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。" G3 R" U) W1 {4 T
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载
体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制
性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因
工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组
克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的
大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）
具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检
测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBluescript! C0 w3 q7 I4 ^+ E3 f: z
（简称pBS）等。: w' E4 O( M3 I! p$ T- G9 O3 N
从细菌中分离质粒 DNA 的方法都包括3 个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离
和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100 可使细胞膜
裂解。经溶菌酶和SDS 或Triton X-100 处理后,细菌染色体DNA 会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于
细菌染色体DNA 比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用; a4 m  c# B* r3 o
强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA 变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular
DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA 片段难以复
性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA 双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋
分子,并以溶解状态存在于液相中。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产生
其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链4 u2 k( Z" i: k& I3 f( L# p
的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA 的两3 W. E. W4 d2 x/ a5 a
条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNA 其超螺& S* \9 C8 r' F5 ^. q& ^6 y
旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。3 w" L! x% E# ^- ]% t+ S
第二节材料、设备及试剂
一、材料
含 pBS 的E. coli DH5α或JM 系列菌株，1.5ml 塑料离心管(又称eppendorf 管),离心管架。1 ^$ p7 A5 Z( L9 h; N" }
二、设备- C. I2 t0 _& j5 p: H
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌# ]2 ~4 S5 m; \2 j: W9 |2 }8 i. o
锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。% V6 V6 H" y( ^
三、试剂
1、 LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，6 b7 Z* c9 o1 t# E/ x5 q- M9 ?
NaCl 10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调pH 至7.5, 加去离子水至总体积1 升,高压下蒸气灭# V  u0 W1 U3 `' A4 t  @5 N
菌20 分钟。
2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加12g 琼脂粉,高压灭菌。! g2 U0 J5 ~. \' S- b
3、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。9 l6 a& c$ {1 F6 Y0 y# R2 ^" u
4、溶菌酶溶液：用 10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)1 A: q2 p2 F) ]& [, |+ ?3 n3 K
保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。
5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调pH 至5.2, 加水定2 r+ ^  O+ r0 m  r: J, L- s
容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。+ `4 ], [! s( r
6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶
液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15 分钟,储存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH 母液稀释)，1％ SDS。
8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。
溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。3 Y8 S1 v% b; I* m. o; U
9、RNA 酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成10mg/ml
的溶液,于100℃加热15 分钟,使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf 管分装成小份保存4 D. z  y+ B0 o) \9 K
于-20℃。. p  K( P. u3 Z! @
10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA 和DNA
的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的+ S3 m" _, W' h7 x4 e2 G/ {  x% ]
0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH 值达到7.6
以上,因为酸性条件下DNA 会分配于有机相。3 P/ ^: m3 X( J) Z1 T! `; x
11、氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相
的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1 混合上述饱和酚与氯仿即+ d; x2 }. I+ Z9 x$ i* A
得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。9 U7 }6 C7 T+ M* v1 ?; m8 a
12、 TE 缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4
℃冰箱中。
13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton
X-100。% G) b% H+ G! S% c
14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
15、电泳所用试剂：（1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA2 ^1 F- e$ i+ g; Z
(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。（2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
第三节操作步骤: G$ w. o9 w% N2 {
一、细菌的培养和收集
将含有质粒 pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。0 ]+ v( y6 l8 a& U. Y9 E: K
用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对
数生长后期。  d$ J8 ?" P% @9 W# J
二、质粒 DNA 少量快速提取
质粒 DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共$ R: R% S5 I; f; h# Z1 Z. G
同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需+ ^/ A) ?. G6 r: X
要。( j6 w& J" g: v7 m- n( ]* o( [* b1 [
（一）、煮沸法) F6 W7 a2 f  W1 i1 Y
1、将1.5ml 培养液倒入eppendorf 管中,4℃下12000ｇ离心30 秒。1 {& e$ W4 r5 X6 n; [8 Z; [6 o; j
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET 溶液中, 涡旋混匀。7 V4 q* c$ n$ n
4、加入10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3 秒钟。
5、将eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出。0 K9 G9 ~- P# M2 _0 J, S
6、用微量离心机4℃下12000g 离心10 分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf 管中去除细菌碎片。
8、取20ml 进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶! [) E; i# i. {4 k7 @0 G2 N
菌。
3. 提取的质粒DNA 中会含有RNA,但RNA 并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及
连接反应等。
（二）、碱法
1、取1.5ml 培养液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 离心30 秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。" c. `9 u1 M, l8 J9 s% K
3、菌体沉淀重悬浮于100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10 分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万2 n6 h7 m3 x9 O4 \& b( {  E
不要振荡),冰浴5 分钟。
5、加入150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10
分钟,4℃下12000g 离心5-10 分钟。7 V$ h. W2 \0 c) T
6、上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心5
分钟。7 C& G( c' Y  Y- P* o* _$ P4 U
7、将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20; P1 n; G* N  e  |# Q9 s0 C3 M
分钟，然后4℃下12000g 离心10 分钟。. J6 U3 w( O+ q. o" f
8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下3 [  ~- W* y" K- l/ V
12000g 离心5-10 分钟。
9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10 分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl TE 缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
[注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋- v, p/ H! E. U2 @5 w' [
白尽量除干净需多次抽提。
3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用# E. M. @2 g- i: J4 w
异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。
（三）、Wizard 少量 DNA 纯化系统
Promega 公司的Wizard 少量DNA 纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15 分钟。5 ~; c4 [/ _% I$ R- l/ W
提取的质粒可直接用于DNA 测序、酶切分析和体外转录等。8 F5 Z9 Y1 u, e& D5 O6 m! @
该系统中所含试剂和柱子可以用于 50 次1-3ml 质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml 细胞
悬浮液，10ml 细胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量DNA 纯化树脂，50ml 柱洗液（使用前
加95%乙醇至120ml )和50 支Wizard 微型柱。0 ~8 v1 \+ D& U5 q5 E" u4 j
1、 1-3ml 过夜培养细胞液4℃下 12000g 离心1-2 分钟。- X/ d( o* {+ n* T+ L" Q
2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf 管中。
3、加 200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。
4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次。
5、4℃下12000g 离心5 分钟，取上清液于新的eppendorf 管中。4 S! e5 D+ S+ {5 ^+ ]* P
6、加1ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。+ M4 t+ x6 P  R+ L
7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard 微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注; z; D/ N7 y# z1 G" q7 ~$ Z* _8 [( S
射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。! b  z3 w$ E. j4 L- A
8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml 柱洗液,并用注塞轻推，
使柱洗液进入微型柱。; b' Y: S, f# H
9、取出微型柱置于eppendorf 管中,离心2 分钟以除去微型柱中的柱洗液。
10、将微型柱放在一个新eppendorf 管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，静止1 分钟后，4℃3 V2 K- i3 Z  |! l$ O
下12000g 离心20 秒。
11、丢弃微型柱，将eppendorf 管中的质粒DNA 贮于4℃或-20℃冰箱。
[注意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10 分钟。; I/ L" K7 h3 L
三、质粒 DNA 的大量提取和纯化. X# K5 I) f; S9 J" n% E, C9 ~
在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒 DNA,为此需要大量提取
质粒DNA。大量提取的质粒DNA 一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
（一）、碱法
1、取培养至对数生长后期的含pBS 质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g 离心15 分钟,弃上$ c" s( N# `" ~# |
清,将离心管倒置使上清液全部流尽。; |! p6 F9 m; |8 w+ |# b
2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml 用冰预冷的STE 中（此步可省略）。
3、同步骤1 方法离心以收集细菌细胞。
4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml 溶液I 中,充分悬浮菌体细胞。: P8 Y" x+ h% u* E- u
5、加入12ml 新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10 分) T+ \1 \- l6 v4 V) [
钟。
6、加9ml 用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15 分钟,此时应形成白色
絮状沉淀。0 \& [5 S; C  B6 Q( O5 I
7、4℃下5000g 离心15 分钟。/ P) U# ]  G; T. y5 v6 I: _/ n
8、取上清液,加入50ml RNA 酶A(10mg/ml), 37℃水浴20 分钟。
9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g 离心10 分钟。
10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g 离心10 分钟。* t+ t( C) h- t+ `
11、取上层水相,加入1/5 体积的4mol/L NaCl 和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60 分钟。& c( W7 P5 ?( B! ?8 Z+ y9 L
12、4℃下12000g 离心15 分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g 离心5 分钟。
13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE 或水中。
[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
2. 加入溶液II 和溶液III 后操作应混和,切忌剧烈振荡。
3. 由于RNA 酶A 中常存在有DNA 酶,利用RNA 酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行
热处理(80℃ 1 小时),使DNA 酶失活。
（二）、Wazard 大量DNA 纯化系统0 X* D7 P3 L2 z( @
碱法大量提取 DNA 往往需要很长的时间.Promega 公司的Wiazrd 大量DNA 纯化系统既简单又快! G+ ]+ L, F! ]$ a; K) G
速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml 培养液中在3 小时以内获得1mg 以上的高质量的! k5 O6 W1 A' C( Z- g4 S6 b& ]
质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA 溶于水或TE 缓冲液中，不含任
何盐份，可以直接用于DNA 序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的, m) s. o8 s( T8 c7 ~
条件下进行体外转录反应等。' M# T! B1 q; N: W* ?1 Z& ^. J  r
该系统中含有的试剂和柱子可以用于 10 次100-500ml 质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细% z# Z2 j* T6 I9 K) @
胞悬浮液，150ml 细胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA 纯化树脂，125ml Wizard8 E$ a5 h) l; Q& Q
柱子洗脱溶液和10 支 Wizard 带有存储离心管的柱子。. @7 H+ ^* W, ?! O& G: N
1、100-500ml 细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g 离心10 分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮: U$ d5 i! J8 a/ s9 u+ g4 C
于细胞悬浮液中。) ~% U. M; y) F  T9 I- f# E- l
2、加 15ml 细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,
溶液会变清,这一步需要20 分钟。' m$ G+ q2 m. B
3、加 15ml 中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。
4、 14000g,22-25℃离心15 分钟。0 w3 E5 B: _7 f/ y
5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。! T5 z0 ?* e5 x
6、加 0.5 倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25℃下离心15 分钟。
7、弃上清,悬浮DNA 沉淀于2ml TE 缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。
8、加 10ml Wizard 大量DNA 纯化树脂溶液, 并涡旋混合。! N% O/ |5 O3 ?. ^1 A7 _9 r
9、每一个样品,使用一支Wizard 大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega 产品,与此配套)。
10、将树脂/DNA 混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA 混合液。
11、将树脂/DNA 混合液抽干后,加13ml 柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA 进行洗0 t4 [$ D$ @1 P0 ]1 {9 c
脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。, l, T9 P# X2 u4 }7 |
12、真空抽干所加入的洗脱。, M' z4 ^2 E) Q6 a7 h
13、再加 12ml 柱子洗脱液进柱子并抽干。( R+ Q! M+ H. n" @) J- U$ c
14、加入 5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管
中,2500rpm(1300g)离心5 分钟。
15、取出柱子，真空抽干5 分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离4 j( Z2 u& N& Z' j- z
心5 分钟。2 N# M5 o* Y0 ?3 m, J
16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE,1 分钟后2500rpm(1300g)离心柱子; [9 {; M, d9 g) Y7 E% E0 {
/离心管5 分钟。
17、取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在4
℃或-20℃备用。! e) b) Y% u, {4 M" [$ }' _
[注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1 加入125ml 95％乙醇。
2. 纯化树脂必须混匀后再用.
（三）、Sephrose 2B 柱纯化质粒DNA
碱法提取的质粒 DNA 即使用RNA 酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA 污染的DNA
制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B 或Sepharose 4B 进行纯化,该方法具有快速,2 |1 \4 E; j  K! e# {9 `9 x
条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA 纯化。
1、将Sepharose 2B 经含0.1% SDS 的TE（pH8.0）平衡后上柱。
2、将至多1ml 的DNA 溶液铺在Sepharase 2B 柱上。
3、待DNA 溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS 的TE(pH8.0)贮液瓶。
4、以1ml 流出液为1 份进行收集。9 l$ ?* e7 ]0 C
5、对每一管测定其OD260 值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA 在柱上流出的第一
个峰中。
6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g 离心2 分钟,将上层水
相转入新管。' C- j, U- I5 ?: ?% F- S. ^' c
7、加入2 倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10 分钟,然后4℃下12000g 离心10 分钟,弃去, l$ |5 O6 M: F* j! M+ m1 x) ]
上清液。5 G8 a0 ]9 N) _. |
8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g 离心10 分钟,弃去上清液。! g( l1 K: m2 d/ Y0 Z; r$ X4 G5 V" C
9、沉淀真空抽干,重新溶于TE 或无菌水中。
[注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用8 x( ?7 h" y* M8 V
含0.1% SDS 的TE 平衡, 以使柱内的凝胶均匀。% D/ D& G, `5 Y. \
思考题+ Y1 Q: i: D; F, A5 Z" ~$ k
1. 质粒的基本性质有哪些？
2. 质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？1 Z: f+ _" g2 R6 s9 u% V
3. 在碱法提取质粒DNA 操作过程中应注意哪些问题？9 y9 o5 D: Y# _. d
第二章 DNA 酶切及凝胶电泳
第一节概述
一. DNA 的限制性内切酶酶切分析* ]) _. K& c% p/ W! Z% S  G
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位! K2 A$ s( x! Y/ X8 p
点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作
用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在
识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),
它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切
酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6
个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别
更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段
(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性* n2 u( ~- Y7 ^2 B7 ]" A
未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。9 U9 d7 \9 f, h& m! \
5'.G↓AATTC.3' →5'. G AATTC.3'
3'.CTTAA↑G .5' →3'. CTTAA G.5'
DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性
内切酶不受RNA 或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步
使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分
别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度
的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶
切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc 和2 倍体积无水乙醇，混匀后置
-70℃低温冰箱30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
DNA 限制性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶
切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA 的无性繁殖、7 \. l- `; \* E. |; D7 M4 \4 M
基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限
制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。: J" r  n1 `, U+ u$ y0 l% I7 Y
构建 DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种0 `! ?# a0 ~+ S* Q
酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。8 d9 m8 |0 G; ]7 J
酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般 DNA 用量约为0.5-1μg。限制性
内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37
℃)。对质粒DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA 加1 单位酶,消化1-2 小
时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。9 }0 _8 q: w3 V( @$ m2 Y! b
二. 凝胶电泳
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法。该技术操作简便快速，: k0 e. f+ [  E) f. Q
可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴
化乙啶(Ethidium bromide, E 染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng 的DNA条带,从而可以确定DNA2 _; F- ~! a0 u
片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 条带,用于以后的克隆操作。8 @7 V! i0 {2 ?+ `: x4 |
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA 片度大小范围较
广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp 至近50kb 的DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度
和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差3 }- H9 b" Q3 O0 b! r% n4 ?
1bp 的DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖
凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳. |- t( S7 _- U
装置进行DNA 电泳。. r% k7 a7 n4 ?- n/ p
琼脂糖主要在DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,
在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
1、 DNA 的分子大小:
线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA 分子量对数成反比，分子越大则
所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2 N! {& l5 ^$ }/ R) B0 N7 h
2、琼脂糖浓度% z# U6 L, z1 S7 S" }. g3 x) U3 q
一个给定大小的线状 DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA 电泳迁移
率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA 分子的大小。分离小于0.5kb 的DNA
片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb 的DNA 分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA 片段大小间于6 `5 K7 u2 `) V+ ]2 ~9 G+ H; U, j
两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、 DNA 分子的构象
当DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同: a/ A% d! ~" |
分子量的线状、开环和超螺旋DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA 移动最快,而线  b" h. a- v6 W! K. f' Z) [
状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA 带难以确定是质粒DNA 不, u' w& X8 W6 a4 a, c
同构象引起还是因为含有其他DNA 引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA 带逐个回收,用同一种限制性内# n  v2 S' v1 W9 f7 i" g& j; j
切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA 图谱,则为同一种DNA。2 b' Y$ |  U, m1 h6 h$ L5 L
4、电源电压. j0 H- P5 g9 X( w
在低电压时,线状DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子( P% E% f. J: N" |+ e( L# y
量的DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因- B$ G5 m' |' c9 Z" b
此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大,所加2 Y5 a- M- }* U* }  m
电压不得超过5v/cm。
5、嵌入染料的存在8 R2 T) U# d; R
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和
带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA 迁移率降低15％。
6、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制
凝胶),电导率最小,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并
明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA 变性。+ q! z$ I6 }' o8 j1 K: G
对于天然的双链 DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸3 j' {* E% j1 X" [3 `  D/ |
和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
第二节材料、设备及试剂- \2 R, K" [+ ^
一、材料! _. k+ W1 o" z! ]# `! I. O
λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS 质料或pUC19 质粒; EcoRI 酶及其酶切缓冲液: 购买成4 @; d; p) ?% B) j6 T
品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。% q9 F0 {  B1 i) W' w) E! b
二、设备
水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,; q; `" Y& |* ]4 F
照相支架, 照相机及其附件。. X/ u1 t! h) ~- \2 J/ |3 L
三、试剂: Y4 S0 S# K5 x/ W: D5 o' S
1、 5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。
2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
3、溴化乙锭(E 溶液母液:将EB 配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。
第三节操作步骤
一、 DNA 酶切反应5 W8 l2 f" u' x: P5 R, R1 @
1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg 和
相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1% Q( d2 O, b3 E6 {: O0 f. e
μl 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个
实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性) ?& Z  l: S5 E$ J; w, a9 q3 J
降低。. i" O. U7 ], C/ L' R/ r/ _
2、混匀反应体系后,将eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保
温2-3 小时,使酶切反应完全。
3、每管加入 2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。0 ~1 B1 G) w8 j/ K; k
二、DNA 分子量标准的制备, X6 b* z1 I. f
采用 EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA 片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA 为长度约50kb9 q! C; T; p$ z8 \4 d
的双链DNA 分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII 切割 DNA 后得到8 个6 j8 ~6 M) X  ^
片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56 和0.12kb。EcoRI 切割lDNA 后得到6 个片段,长& p9 e+ N: z0 E7 O# k7 Q: H
度分别为 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和2.5kb。
三、琼脂糖凝胶的制备$ d) y+ D$ f4 u  v! V+ q1 W! n) x
1、取 5×TBE 缓冲液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。' p% |9 V& L4 e3 J+ ?0 P4 X
2、胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入
微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇
动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。5 ]% U$ K0 x3 p9 P: ^. z
3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水( W3 ]- `& @& p5 F+ u7 o
平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。
向冷却至 50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E 溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB 加入
凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml 的EB 溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡; ]+ s" t' O% i8 O! M  L
皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的
温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不
要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应
样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样：取10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA 含
量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip 头,以; A% Z$ ?# n* u. b' ?2 d2 ]
防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。$ [8 H) [+ c3 O' a
5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA 以上。' p4 L; k; t1 [0 w
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时,停止电泳。
6、染色：未加 EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中,室温下染色20-25 分钟。; w/ z. s1 e5 h$ A  u
7、观察和拍照：在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB 的电泳胶板。
DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以
免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，% z7 G" g* M% _# ^+ q& W' Q6 @
光圈5.6,曝光时间10-120 秒(根据荧光条带的深浅选择)。
8、 DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA 的  ]0 X5 t% s- R& N. `, `
EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为
横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA 分子量的标准曲线。+ C& \1 O( j0 T/ b+ O" N
9、 DNA 酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA 样品各片段的迁移距离,
根据此数值,在DNA 分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单- n8 C* R- j4 A. n3 ]. d
对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA 片段的大小)。反之,若已知DNA 片段的
大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。$ S) J3 l% _1 P! ^: n
10、 DNA 酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA 酶
切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状
图或直线图表示,即成该DNA 分子的限制性内切酶图谱。
[注意] 1.酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。
2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1 小时完全降解1mg' z- d: `$ R( Y. u& p+ U
lDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA 不象lDNA 那样易于降解，需适当增加酶的使用+ n  F$ B% I. r  ~
量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。7 J$ d$ d6 L) u4 q, k, e  V. o
另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10 之下，否则，酶活( K4 |8 T2 @, c; v  s" s
性将受影响。) w& h0 M4 b$ Z; ^8 v" U
4、观察 DNA 离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA 分子有切割作用。从胶上回收DNA 时,应尽
量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。/ r0 [( P* [. l9 g# K/ Q
5、 EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB 洒到桌面或地面上。
凡是沾污了EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
6、当 EB 太多,胶染色过深,DNA 带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30 分钟后再观察。
思考题1 ^! p- U8 P0 J7 x5 c3 s$ z, H
1. 如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动, 你认为可能是什么原因？4 j* s. _: n- J! [! I- _# B
2. 琼脂糖凝胶电泳中DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？7 n% T% s) m9 y& {* i7 m
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化7 h) Q0 h6 _2 f% f) ], m
第一节概述8 |6 ^$ X* y4 a9 D$ U* ~
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,6 a$ O) ]& M* h7 P
一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需
将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。4 Z, s- m  E% M) V4 d
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是
微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的* w- \( B4 S- `8 R/ l) W. n6 l; C! e
突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方
法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能
允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实, b4 T+ @) o* f
现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可% T1 H" K4 ]7 l7 G9 n1 B$ t1 D+ H1 v
筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有- q: e: N) }' i9 o9 G* I- p  x* N! J
CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化8 g/ L2 B1 y2 C
效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘+ ^3 z' D" j8 ]$ Y
油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油
保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通7 Q+ z! E7 S7 Y# B
过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不
同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源7 b" ~- S1 v" L! ^
DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng 的cccDNA 即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态
细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分( m- p3 B/ K. }$ l2 F; H
装保存于干燥的冷暗处。, J7 |  R' M5 A
4. 防止杂菌和杂DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip  D# u. q5 q: i$ ]& s+ m: }
头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA
所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。3 n/ Y0 l3 W3 v  Y' {* O6 v
本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与pBS 质粒共保温,
实现转化。由于pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。如受体& V: v5 c8 F. g. T
细胞没有转入pBS，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）
肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。3 @$ ]6 w3 O; e5 V$ k9 u
本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与pBS 质粒共保温,
实现转化。由于pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。如受体
细胞没有转入pBS，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）
肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
第二节材料、设备及试剂  R% ]! J& M6 t
一. 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS 质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf 管。
二. 设备; j! J7 y- H3 f- g  I& A
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光
度计,微量移液枪。! o1 W4 u& N3 G
三. 试剂$ ?4 W% N) Z9 ^4 `0 X0 X
1.LB 固体和液体培养基：配方见第一章。/ k1 D8 j" O9 s7 h
2.Amp 母液：配方见第一章。) L9 m/ d/ t! X$ P: W0 H% h
3.含Amp 的LB 固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp 储存
液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。2 |3 L! Q  x4 V! P2 B2 V: \* V
4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g 麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高
压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp 储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
5.0.05mol/L CaCl2 溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,定容至100ml,高压
灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入# f& s9 ]+ L3 K  V8 B, V
15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。0 G9 g& c! a9 _* \
第三节操作步骤
一、受体菌的培养
从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡培养
12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50 的比例接种于100ml LB 液体培养基中,378 l, Y8 e7 a. }2 D) n' y
℃振荡培养2-3 小时至OD600 ＝0.5 左右。
二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10 分钟,然后于4℃下3000g 离心10 分钟。* T2 u) y0 E9 V# M0 L0 k; h8 N
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30 分钟后,4. k  n3 j  C1 h1 \; A3 s
℃下3000g 离心10 分钟。
3、弃去上清,加入4ml 预冷含15%甘油的0.05mol/L 的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分
钟,即成感受态细胞悬液。) w' B8 u. i! S) X: L0 [! G
4、感受态细胞分装成 200μl 的小份,贮存于-70℃可保存半年。
三、转化; L% W5 Y1 F2 U  i
1、从-70℃冰箱中取200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、加入 pBS 质粒DNA 溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30 分钟后。' ]8 T- D/ _2 B7 J3 f) g
3、42℃水浴中热击90 秒或37℃水浴5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟。  O2 E) I& v4 B: ^: r; J! v6 F/ r
4、向管中加入1ml LB 液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1 小时,使细菌恢复正常生长7 M# S8 k5 d" V
状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。  s/ d- M) X+ \: E! U1 |2 ~
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全1 z( ~8 c2 ?6 @8 t
被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24 小时。
同时做两个对照:
对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗
生素的LB 平板上应没有菌落出现。! R" U/ W0 \4 Z( Y+ o
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB! T3 V$ {" |/ b. {& F
平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
四、计算转化率8 s( p$ W8 [/ @6 x- x
统计每个培养皿中的菌落数。& N6 ]* e! t6 K! r; K' k" S9 i
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和% t# I8 f" s: Q2 ~  }) w
转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每 mg 质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA 加入量(mg)  @6 a0 x7 `$ K7 y- I! Y
感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数4 A# W5 v( l. P6 Y; u  O; m5 j; z
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA 的转化。但它们的转化效率  V: @  }2 A7 t! S6 x; E
并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化9 L  c+ t/ _" }1 x5 w$ j) _
效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
思考题3 [" _, _) F, }, B" q; m/ B
1. 制备感受态细胞的原理是什么？! Y) P! r) K8 V8 ]( d
2. 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？
第四章 RNA 的提取和cDNA 合成4 q- q2 {6 j# {5 ]  l# n" r
第一节概述
从真核生物的组织或细胞中提取 mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA 的第一链和第二链,将双) _6 I# h2 v/ ~; `
链cDNA 和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA 文库,构建的cDNA 文库可用于真核生物基因的结
构、表达和调控的分析;比较cDNA 和相应基因组DNA 序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工( v9 O) l+ P8 w6 z% \( @
等一系列问题。总之cDNA 的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70 年代中叶首
例cDNA 克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA 合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前( D0 m% ]7 E0 a" y; @2 \. }5 ~
cDNA 合成试剂已商品化。cDNA 合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA 第一链,聚合酶合) T2 Z% x& `0 n/ k
成cDNA 第二链,加入合成接头以及将双链DNA 克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。' g) D7 T( H3 H* g
一、RNA 制备
模板 mRNA 的质量直接影响到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的结构特点,容易受RNA 酶的
攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设' I- p3 z3 a/ S% {8 }( b' [' L  h1 G
法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等
均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器3 t- J4 v- ?6 z) S
皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2 小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%9 T. v4 b. g+ r& s5 _
的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是RNA 酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活+ G4 G: V! _" l+ D8 M5 P
性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。& |4 I% o* B% Q! }' @
试验所用试剂也可用DEPC 处理,加入DEPC 至0.1%浓度,然后剧烈振荡10 分钟,再煮沸15 分钟或高3 l1 h, m# l" U8 ?" S
压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA 活性。但DEPC 能与胺和巯基
反应,因而含Tris 和DTT 的试剂不能用DEPC 处理。Tris 溶液可用DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。
配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC 处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC 外,也可用/ m6 ~2 Z( ?, Z* m" C, Q
异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA 或cDNA 吸附在玻璃或
塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。
细胞内总 RNA 制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA 提取试剂盒,5 Y8 H6 n- c" ?- A
可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA 可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当
RNA 流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA 被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后
逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA 被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯
的mRNA。纯化的mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
二、cDNA 第一链的合成9 v- p3 T0 N& w) [* t
所有合成 cDNA 第一链的方法都要用依赖于RNA 的DNA 聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商  y) L1 A" @8 N" P
品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化/ d" `# J3 \9 I6 A7 @
的Moloney 鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV 反
转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA 的DNA 合成,依赖于DNA 的, S% m: k' Z! f0 F- J
DNA 合成以及对DNA:RNA 杂交体的RNA 部分进行内切降解(RNA 酶H 活性)。MLV 反转录酶只有单5 T, j- G) U; X
个多肽亚基,兼备依赖于RNA 和依赖于DNA 的DNA 合成活性,但降解RNA NA 杂交体中的RNA 的能
力较弱,且对热的稳定性较AMV 反转录酶差。MLV 反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV! A6 U7 d6 a# d7 Q% k
反转录酶和MLV 反转录酶利用RNA 模板合成cDNA 时的最适pH 值,最适盐浓度和最适温室各不相同,
所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。' ~9 l; c9 Z1 C5 x2 e% q* z! ~! n4 f* y
AMV 反转录酶和MLV 反转录酶都必须有引物来起始DNA 的合成。cDNA 合成最常用的引物是与- p4 q1 y8 G6 M
真核细胞mRNA 分子3'端poly(A)结合的12-18 核苷酸长的oligo(dT)。  I: @/ Q- d$ \: t. s& ?
三、cDNA 第二链的合成
cDNA 第二链的合成方法有以下几种:5 h0 W1 n% V( M5 L/ P5 [
(1) 自身引导法合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现
成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA 杂交链变性后利用大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片/ G, |) l# _% x0 @% j
段或反转录酶合成cDNA 第二链,最后用对单链特异性的S1 核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身( |; C/ [3 _; a$ E) N* j* v! Z; j
引导合成法较难控制反应，而且用S1 核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序' @9 d/ B+ d9 B; X  I+ U" Z/ j5 H
列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。5 d$ d- P) q* D2 R4 l
(2) 置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA 杂交链不用碱变性,而5 p+ V8 j6 p1 Y
是在dNTP 存在下,利用RNA 酶H 在杂交链的mRNA 链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA 引% N' w3 k' s* H4 {& c4 Y
物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3 个主要优; H2 Y+ b+ j2 p1 t- G; j- p
点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1 核酸酶来
切割双链cDNA 中的单链发夹环。目前合成cDNA 常采用该方法。' @. _8 v% s; u1 @- f. y
四、cDNA 的分子克隆6 @0 z6 ?# f; W
已经制备好的双链 cDNA 和一般DNA 一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接
头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端! Q9 p: {# ?  _. I8 P
接上一段寡聚dG 和dC 或dT 和dA 尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的& p; j9 S& t' h0 b$ `/ Q, K& t. \
cDNA 也可以经PCR 扩增后再克隆入适当载体。7 Y8 Q" Q4 I7 b: Y
第二节动植物组织 mRNA 提取% C" `6 K9 {" `5 g5 p* a
一、材料
水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备6 |5 `8 ~& }0 d# [$ A- n0 _
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂
1、无RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2 小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的
DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。$ Y& X6 L; l& W; C& j$ S$ X) i/ ?
2、75%乙醇：用DEPC 处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻6 o5 D7 H( q+ d
璃瓶中，存放于低温冰箱。' {9 I: P' ~$ g5 v5 a
3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，- L; i' p, @# V2 U
0.1% SDS。
4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。
四、操作步骤
（一）动植物总 RNA 提取-Trizol 法
Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol2 `( y- K' e+ [* w4 }0 t3 M
法提取的总RNA 绝无蛋白和DNA 污染。RNA 可直接用于Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+
分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N 中磨成粉末后，再以50-100mg 组织加入1ml Trizol 液研磨，注意样品总体积' C+ `( C5 _  P1 g9 Y0 E/ D* n6 l0 l
不能超过所用Trizol 体积的10%。
2、研磨液室温放置5 分钟，然后以每1mlTrizol 液加入0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用
手剧烈摇荡离心管15 秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol 液加0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置
10 分钟，12000g 离心10 分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g
离心5 分钟。8 L, ~3 J$ j: U& l
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的# M* v  ~0 d' K2 \; @+ X4 a
溶解度。然后将RNA 溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10 分钟。RNA 可进行mRNA 分离，或贮
存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。8 \7 h* m0 Y( l! a# o  \
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA 沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20
℃保存一年。9 N6 O. m$ U% ^8 H" X) t6 K. a
（二）mRNA 提取, U/ k( f2 U3 h9 }* T
由于 mRNA 末端含有多poly(A)+，当总RNA 流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，6 N6 P; V" J+ o/ R& G) ^
mRNA 被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA 可被洗下，经过两次
oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH 悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。% B  p( }- G) }! k7 g: g' l3 [
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯
德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH 值小于8.0。0 y( P: g: T0 ]# x6 B& q" S
4、将（一）中提取的RNA 液于65℃温育5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x 柱层析缓冲% l* @+ U1 p% V3 e$ v( j% M
液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA 溶液进入柱床后，加入1 倍柱床体积的1x 层析0 P+ j& ]$ \0 n0 i: h
柱加样溶液。) y! i% ~8 t6 e! w
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD 为0 时，加入2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以
1/3 至1/2 柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260，合并含有RNA 的洗脱组分。4 A. k# e( B) M3 B9 i4 b, p
7、加入1/10 体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀， -20℃30 分钟。
8、4℃下12000g 离心15 分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g 离心* u& x; U8 c% A
5 分钟。# A$ j( P1 y% L$ A7 B% t2 O; |
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10 分钟，或真空干燥10 分钟。' d+ m( N  l/ r& `4 B8 p' q+ c$ Z5 I
10、用少量水溶解RNA 液，即可用于cDNA 合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。$ a6 ]- p8 H! S+ D% j/ e( f
2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入+ P9 }& e/ c! j
0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH 水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。% D7 P* a. L: d
第三节植物病毒 RNA 提取
大多植物病毒 RNA 为单链RNA，并且其极性与mRNA 极性相同，植物病毒RNA 提取较为简单，# z- C' g+ D" {$ |' L" U
一般使用酚氯仿即可获得满意结果。* m2 }/ ?5 U  T' K& N( M
一、材料
提纯 TMV 病毒液（10mg/ml）。. p( D! u& x5 U& F" T* [
二、设备
冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。) z4 R9 R, T$ h
三、试剂
TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液，无RNA 酶4 A& M# f2 ^: i2 H
的双菌水。+ O+ ?. J; F" M# e) n4 C
四、操作步骤
1、取一eppendorf 管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手
充分振荡1 分钟，4℃下12000g 离心10 分钟。
2、吸取水相于一新eppendorf 管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
3、吸取水相于新eppendorf 心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g 离
心10 分钟。
4、取水相，加入1/10 倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30- x/ V: \2 |* s) Y
分钟。9 t& h! Y4 J  i" Q+ r; ~4 R
5、4℃下12000g 离心15 分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g 离心51 B% P2 W6 c5 s0 X
分钟。. R+ ~# b' X( |$ t  K
6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5 分钟或空气干燥10 分钟，并溶于无RNA 酶的双菌水或TE: L/ Y& {( Z! O# G: Z
缓冲液中。
7、取10ml 进行电泳分析，另10ml 用于cDNA 合成。0 i* i# {7 Y% y. {* u" _- z8 b9 L( B- V
[注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。
2、由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/9 f8 `8 h( ^* [! H) K$ ]6 U  C
氯仿的抽提。7 y, o- V2 Y8 I2 y
第四节 cDNA 合成技术) D6 w( F0 k2 F, b
一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA 合成技术! A  h. w4 \; l' G) t1 U' ^
Promega 公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA 合成系统采用M-MLV 反转录酶的RNase H 缺失8 o. f, i; V" M3 _: ~: S# ^
突变株取代AMV 反转录酶,使合成的cDNA 更长。该系统的第一链合成使用M-MLV 反转录酶,cDNA 第; W3 Y" P3 a% T5 V7 s$ t* A
二链合成采用置换合成法,采用RNaseH 和DNA 聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA 聚合酶切去单/ E' }* p* C5 C4 s) o  S
链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：4 }, M  T4 T. \* i
20μg 特异性引物8 a: N  S6 G" C1 z1 _4 z0 p% R
200μl M-MLV 第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl;; v# |7 m& q8 E1 m9 r+ B+ A* Z% R
15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP 混合物(各2.5mmol/L)
2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制剂9 p" F/ B" d, s) V/ U: Q; _' e5 _
10,000μ M-MLV 反转录酶, RNase H-$ F, s5 i* X! {# i! s  f- f4 P
5μg 对照RNA
400μl M-MLV 第二链缓冲液(10×)，配方如下：4 f0 ~- D7 ?, p8 L: Z9 L# c+ ]
400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。3 Z7 s' |* j0 _/ x+ M
500μ RNase H6 [' l( @2 `) }# Y6 ]
500μ DNA 聚合酶Ⅰ
100μ T4 DNA 聚合酶Ⅰ0 [+ y, j6 l, Q$ |* v5 M
2×1.25ml 不含核酸酶的水7 u, j2 a; z8 C* g. ?" X9 x
以上所有试剂除对照 RNA 需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。+ P  P  p( _: {6 B! f: |
（一）第一链合成
1. 试剂7 u2 x1 n% C7 M7 J6 I
[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM 和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，) L5 k! F$ S6 i
乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液。
2. 操作步骤3 ^+ F" d6 E# z% A
(1) 取一灭菌的无RNA 酶的eppendorf 管,加入RNA 模板和适当引物,每μg RNA 使用0.5μg 引
物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O 调整体积至15μl, 70℃处理5 分钟,冷却至室温,离心
使溶液集中在管底,再依次加入, n) y" _* i7 t7 h% Q
5×第一链缓冲液 5μl
rRNasin RNA 酶抑制剂 25U) x$ T& I8 j, f0 t6 w
M-MLV(H- )反转录酶 200U1 z' B/ a5 b6 s- S2 f( Q- @7 D6 G
H2 O 调至总体积25μl
(2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl 至另一eppendorf 管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),) j  X+ e& U2 ?$ P% j  p6 |
用以第一链同位素掺入放射性活性测定。9 L/ X# B4 g' i2 Y& x6 g0 {" F& q  N
(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1 小时
(4) 取出置于冰上) [2 p' @8 W1 }1 u0 l/ ~2 X* i
(5) 掺入测定的eppendorf 管加入95μl 50mM EDTA 终止反应,并使总体积为100μl。可取90+ f+ ?- v' P2 |4 |/ H
μl 进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl 进行同位素掺入放射性活性测定。
第一链合成 eppendorf 管可直接用于第二链合成! c, ?) Q) M8 R: Z5 s1 F
注：以上25μl 反应总体积中所用RNA 量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒) {* R% G3 @) g
5μg RNA 使用125μl 总体积进行合成。. I6 r2 L* S4 l) d- J( s, t' A
（二）第二链合成
1、取第一链反应液 20μl, 再依次加入( w# r& `' A7 y: U/ T
10×第二链缓冲液 20μl
DNA 聚合酶Ⅰ 23μ
RNase H 0.8μ
H2O 加至终体积为100μl! }6 G/ a6 N: g! a5 r! ]
2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl 至另一eppendorf 管,加
入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
3、14℃温浴2 小时(如需合成长于3kb 的cDNA, 则需延长至3-4 小时)。, \$ T) q0 {* J1 r) O
4、掺入测定eppendorf 管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl 进行同位素掺入放射性测定,余下( p, h6 a8 M6 F( P" ~, [, u4 Y, y% A
的可进行电泳分析。
5、 cDNA 第二链合成离心管反应液70℃处理10 分钟, 低速离心后置冰上。4 ^2 [0 Q7 ^) w+ }
6、加入 2μ T4 DNA 聚合酶, 37℃温浴10 分钟。) N  m; ~  ~# Y8 u. s. s
7、加入10μl 200mmol/L EDTA 终止反应。
8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA 反应液,离心2 分钟。& H# _8 A/ l! |; @$ h' v
9、水相移至另一eppendorf 管,加入0.5 倍体积的7.5M 醋酸铵(或0.1 倍体积的1.5M 醋酸8 H4 {, _5 x! _% c  ?! R7 p
钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5 倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30 分钟后离心5 分钟。
10、小心丢去上清液,加入0.5ml 冰冷的70%乙醇,离心2 分钟。
11、小心移去上清液,干燥沉淀。
12、沉淀溶于 10-20μl TE 缓冲液。7 u' _6 N3 B$ c! r$ H
（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析' G  k$ D0 t3 c& F0 Z
1. 试剂
1mg/ml 鲑鱼精DNA，三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（ 30mM- z+ B  y3 q" Z
NaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。
2. 操作步骤; u+ g* N0 A; k. B# P
(1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活
性。, Q; A: A8 g( y
(2) 同样各取3μl 中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA 中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡; W$ X( F- O. q
旋混合仪混合后置冰上5-30 分钟。: g# X8 \. X1 l3 F2 p
(3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA 洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml 丙酮或乙醇漂洗,
这些样品代表掺入放射性活性。" f. i% s6 m* s# e$ d# y: I$ ]5 `, I: c
(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。5 {$ r# v3 F( I) L. A
3. 第一链产量测定
第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%; U! f* L; ]( K. B3 A
掺入 dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)+ j) }* X2 C- A" P" F9 m- J  N
设 330 为每mol dNTP 的平均分子量
合成 cDNA 量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol$ O0 ], }# }$ E/ f" b
mRNA 向cDNA 转变率=合成cDNA 量(ng) / 模板RNA 量(ng)×100%; ?" m5 `0 b; C. E0 d/ G
例如总放射性活性强度为 254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA 摸板量为1
μg,反应体积为25μl, 则:
掺入率＝3040/254000×100%=1.2& G7 M1 I' i! n
掺入 dNTP 量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol% d3 o0 r" o9 G
合成 cDNA 量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng$ m) I, h5 ~# e% ], m5 x
mRNA 向cDNA 转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于 1000ng RNA 中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链  B! H, W2 q" f, ^, |/ Z* a! O
cDNA 合成量为0.8×198ng=158ng。; w# E5 i( ^5 P/ n2 q3 Y
4. 第二链产量计算
除需去除第一链掺入 dNTP 外,方法同第一链产量计算9 @/ S6 t! P" x5 y
第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性??
掺入 dNTP 量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入nmol]×第二链掺入率4 b+ t9 z- h0 p- o$ W% u) `, l
第二链 cDNA 合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol& h. w+ ^$ r' a  O' s: p, D3 ?
双链 cDNA 转变率=双链cDNA 合成量(ng)/ 单链cDNA 合成量(ng)' V0 p" I2 s$ N5 }
例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp, 总放射性活性强度为235000cpm.
第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%2 I6 T; P; D0 h) k0 x) G1 j
第二链合成 dNTP 量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol
合成第二链 cDNA 量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng1 i9 j  u% y  i
双链 cDNA 转变率=155ng /158ng×100%=98%
一般 cDNA 第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。
（四）电泳分析( `# d0 L$ F& `* w% `: O0 ]; I
通常合成的 cDNA 第一链和第二链长度为350-6000 碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一! K6 k. w/ ?0 Y3 D6 `
链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的9-12 步，
一般第一链和第二链上样量相同。
1. 标准分子量DNA 参照物的同位素标记3 w) q6 Y  S7 N) a
(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA 聚合酶进行32 P 标记
10×HindⅢ缓冲液 2.5μl& S7 r5 M- a" t( D, P
dATP 0.2mmol/L: v$ b' w, y3 c& ]3 C6 M4 x
dGTP 0.2mmol/L
[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi
λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg
Klenow DNA 聚合酶 1μ7 K6 g4 M8 q0 m1 X/ F7 R
加 H2O 到总体积25μl
(2) 室温放置10 分钟, 加2.5μl 200mM EDTA 终止反应, 加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。1 `0 B0 i$ k. T+ G4 p
2. 电泳分析
(1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA 制备1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30 分钟。
(2) 取样品液, 用TE 调整体积, 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样+ P' p& N8 x" L9 ~* s3 A, L
品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉兰）。
(3) 加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3 处，电泳缓冲液为30mmol/L NaOH, 1mmol/L" u, _( |! ]! L* J' L% q# j7 D
EDTA。0 }$ E5 t, G* O  }8 W8 e
(4) 将胶浸入7% TCA 中,室温放置30 分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小7 ~; S  l6 L5 a. L, Y
时。
(5) 用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X 光片(用增感屏时-70℃压片)。6 n# I! X% t: H7 U
二、其它 cDNA 合成技术( f4 {0 s9 k: V8 d4 N5 t2 @* L
除 Riboclone M-MLV(H-)cDNA 合成技术外，Promega 公司还提供有多个AMV 合成试剂盒，不同3 n' o1 J) w7 u: E1 \5 T  |
试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ  a, K! t# {, T- [6 ?; C
引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等，其余试剂一样，这些系统包括：
20mg 引物
20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下：
250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L7 J. e! Z4 Q' }8 y8 h7 ]( B; g
MgCl2; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;% j! R5 m% b9 x7 _" s1 s* K' K6 X
20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。
50ml 40mM 焦碳酸钠. c: o) G' e/ J; f- p9 M
625m rRNasin RNA 酶抑制剂' D4 v! [, ^5 L! @+ ^9 o
600m AMV 反转录酶- b& I4 B) {8 g
5mg 1.2kb 对照RNA
200ml 10×第二链缓冲液，配方如下：9 B8 w2 h7 S; \8 K
400mmol/L Tris·Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L
MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。' I. O8 C4 H) a, s" M2 k- p" Q
2m E.Coli RNaseH3 U( Q8 k( o7 L% c& A& M% R4 u1 n
500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ0 I% @% C' g; s# O2 k
100m T4 DNA PolymeraseⅠ
1.5ml 不含核酸酶的水
以上所有试剂除对照 RNA 需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。1 f% ]! r! R% O( Y; A8 B0 s
（一）第一链合成
下面介绍的是 25ml 体积反应系统，该系统可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加: r3 W( \6 o% ?0 T2 a1 r" J2 d
反应体积10ml，如5mg mRNA 需55ml 反应体积。. p, e, I- m* \
引物或引物-延接头和反转录酶与mRNA 的比例应分别保持为0.5mg/mg（对NotⅠ引物-延接头
为0.3mg/mg）和15m/mg.
1、试剂：
[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM 和200mM)，TE 饱和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%( Q3 b0 \' n( Q6 f# A% z. d
和70%乙醇，TE 缓冲液(10mM Tris·Cl,pH8.0,1mm EDTA)。) w9 u0 U8 }8 s9 B6 K
2、操作步骤：
（1）取一灭菌的无RNA 酶的eppendorf 管加入的RNA 样品，及引物或引物-延接头，用H2O 调
节0.5mg 引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接头/mg mRNA）的体积至15ml，70℃加热5 分; [8 N% W0 B( W5 Q! a" D! g, ^9 J
钟，待冷至室温，离心数秒钟使溶液集中在管底，然后依次加入：5 h2 |& n9 U1 @8 I/ Y5 R$ u
5×第一链缓冲液 5ml% o3 D$ X3 R6 T, q
rRNasinR RNA 酶抑制剂 25ml5 z2 {. z' ?/ u' E( r1 F
40mM 焦碳酸钠2.5ml
AMV 反转录酶 15m/mg RNA
加无水 RNA 酶水至总体积25ml
在加入焦碳酸钠和 AMV 反转录酶前，需将反应液42℃温浴5 分钟，以阻止焦碳酸钠沉淀。焦碳8 o8 p! @2 w( Y( I% q
酸钠主要用于抑止第一链形成发夹结构。1 _( g2 f2 x" B( F  {+ v
（2）轻弹eppendorf 管，取出5ml 至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其体积不能
超过1ml），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
（3）42℃温浴1 小时。
（4）取出置冰上。
（5）掺入测定的eppendorf 管加入50mM EDTA，终止反应，并使总体积为100ml。可取90ml' Y6 O( e, i8 ?& B5 @/ E: n
进行电泳分析，另10ml 进行同位素掺入测定。
（6）第一链合成离心管可直接用于第二链合成。1 P$ T- k: R  \; b" l* S  c% c) S, t7 b  |
（二）第二链合成* D  N' J% H& r' V1 Q, ?. ^9 j
第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。
1、第一链反应液（20ml）中依次加入, x! M  S9 c+ _( n1 G
10X 第二链缓冲液 10ml
E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m
E.Coli RNaseH 0.8m! C) F' C3 k$ y& t
加无核酸酶水至总体积 100ml
余下步骤同本章第四节一（二）2-12 步及（三）和（四）。
思考题:
1. 为什么mRNA 提取是cDNA 合成成败的关键？" ]* I; w7 a' p( d3 `6 N3 |
2. 试比较自导引导法和置换合成法合成cDNA 的优缺点。* N" B4 z( \% @5 x  q& h. B! O
第五章重组质粒的连接、转化及筛选
第一节概述; h# Q3 G$ I- P$ {8 G) o# j, Q
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的 DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要
比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质
粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实' e. @) t/ _9 g; A- a
际工作中, 如何区分插入有外源DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通
过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,
也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以. }2 ]# v0 S2 }3 I  u+ V
利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。, {5 v& m) B( t; I7 r3 p
外源 DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：5 w% Z8 B# ]2 u5 W8 o& D: O! p8 x
1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末' {1 q! l* |# s1 ]6 ^+ M$ b2 w0 B
端,这也是最容易克隆的DNA 片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成! H/ }1 C. W; Q2 N& z
的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA 片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片
段定向地克隆到载体上。也可在PCR 扩增时，在DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相! R# w. K% l, l6 _
连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用1 T1 n! L: y% T6 [
同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA 均可
能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整/ J" O* f1 E% a3 s- b3 _1 Y
连接反应中两种DNA 的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA 的5'磷' G7 }0 B# k( S* Y3 k/ ?% N' @
酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA 的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA 片段可
以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli 受体菌后的扩增
过程中缺口可自动修复。" s7 x3 k( O; c4 }' Y5 S# G
3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA 聚合酶补平所致。
由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA 连接酶的浓度和外源DNA 及0 E1 Q0 O6 ]! v6 ]) c" u# u
载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA 分子凝聚成聚集( {# s. C- M+ l/ c& a8 S/ E
体的物质以提高转化效率。7 }5 b. E5 {% j8 t9 X
特殊情况下，外源DNA 分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外% j- P8 m5 s' \7 ~6 x) U/ q! S
源DNA 片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli
DNA聚合酶Ⅰ的klenow 大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再
进行连接。7 }/ H9 D3 H0 f/ D; u: l" I% D
本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和3 T" b/ K. i* }( f( z7 B4 w
lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。
因 pBS 带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA 的转化子才$ E& b8 k3 W" }# p( }
能在含有Amp 的LB 平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步
的抗性筛选。- e! U, R' F9 ]' ]5 N
pBS 上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸的编码序列。
这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5
α菌株带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS 和DH5α编码的β-; e+ u2 o- T$ L# P/ {  z- D3 b9 \
半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS 和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种6 v) \8 {! t6 D& ^" P: f! f: a1 K
lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体
之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4, |% k4 I! e9 U$ Y2 @  V: M" b
氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源7 ?* ^& f- T2 j; `& l, |
片段插入到pBS 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去2 `& @+ j, q1 G# O! \: c
α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康
凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳
酸，使pH 下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳7 q# U: |) \' N9 }+ R
糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA 分开。
此为α-互补现象筛选。/ R# x- v% p, g/ X5 @- A7 ~
第二节材料、设备及试剂+ b/ U* t! W5 A5 L  X: k$ n
一、材料% A( Q- |7 @. F9 M2 }; J: H, d
外源 DNA 片段: 自行制备的带限制性末端的DNA 溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS 质粒
(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM 系列等具有α-互补能力的菌株。
二、设备
恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无
菌，工作台，微量移液枪，eppendorf 管。
三、试剂- `' \: }5 N; |+ J0 e
1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖% |, q2 d% w0 I* i- F
醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L ATP（过
滤灭菌）。
2、T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
3、X-gal 储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml 的储液, 包以铝箔或黑纸
以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
4、IPTG 储液(200mg/ml): 在800μl 蒸馏水中溶解200mg IPTG 后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22+ B, n. ?9 K, f/ R5 d( d
μm 滤膜过滤除菌，分装于eppendorf 管并储于-20℃。) \: p( V( [. G' U. h4 I; l
5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g 麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完, a4 g" b8 s& Z+ R+ w7 b# d2 r; E, h
全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp 储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。
6、含X-gal 和IPTG 的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp 的LB 平板表面加40ml X-gal
储液和4μlIPTG 储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面的液体完全被
吸收。# X* F* q7 ]# X# ^
7、感受态细胞制备试剂: 见第三章。0 |5 U" c# {1 a( F" d# @  L
8、煮沸法快速分离质粒试剂: 见第一章。) o- b. s, {) v  T& W$ l- ^
9、质粒酶及电泳试剂: 见第二章。9 g4 I' `) F1 @% J  |' d6 U
第三节操作步骤
一、连接反应/ x2 p9 Y" z; @8 Z3 W) E
1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf 管, 编号。
2、将0.1μg 载体DNA 转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA 片段。, |5 a9 j, j; d5 r- V. f% a
3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5 分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。
4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部
甩到管底,于16℃保温8-24 小时。
同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源 DNA；对照组二只有外源DNA 片段没
有质粒载体。
二、 E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化9 l9 f/ e" h; n5 t- t
每组连接反应混和物各取 2μl 转化E. coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。
三、重组质粒的筛选8 k" @: q: ]3 \
1、每组连接反应转化原液取100μl 用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以
上,直至液体被完全吸收。
2、倒置平板于37℃继续培养12-16 小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。' a* t1 S; j5 X* q. C4 b1 P
3、放于4℃数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做）。
不带有 pBS 质粒DNA 的细胞,由于无Amp 抗性,不能在含有Amp 的筛选培养基上成活。带有pBS$ E4 l, o, G+ b* c
载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal 和ITPG7 z% U# P3 ~" G. U7 M( e& H
培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和( u7 s) t9 p" l2 Z6 N" ~
x-gal 和ITPG 培养基上均为白色菌落。
四、酶切鉴定重组质粒5 J/ m& m5 |& _4 R* |
用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含 Amp 50μg/ml 的 5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡培养9 J. I2 j2 ~5 C. z3 t* b
12 小时。