间充质干细胞复苏问题

lgh1986

冻存细胞一般2ml管里装1-1.5ml吧，复苏时应该在40度的水域里迅速融化，要全是液体，不能存在冰块，然后转移到15ml管，加培养基至10ml，也就是稀释十倍，然后再离心，这样可以减少冻存液对细胞的伤害，这是我们实验室的常规复苏方法，复苏效果如何还决定于你冻存时细胞的状态，冻存前一天最好更换新鲜培养基，希望对你有帮助。

shiqingxi

我觉得是你在复苏时候融化成半冰半水后倒入培养瓶时候出的问题。我们都是在37度融化后才离心的 ，因为细胞在跨越冰点的时候伤害最大，你的细胞死亡可能是这个原因。个人观点！

maxiaona

复苏的步骤应该没问题吧，还是考虑冻存时是否有问题，要不然就是复苏后的培养有问题。% F. g3 y7 B" u' G( I
复苏后有没有变换培养基或培养条件。

83801754

40度水浴摇晃一分钟左右，最重要的是细胞的密度不能太低，否则就算是贴壁了，也很难长起来，而且确实会有不少细胞复苏后是不会贴壁的，下次换液的时候基本上就会换掉了，剩下的贴壁细胞密度太低的话，基本也就没指望了，个人经验，希望有帮助

nydfy

冻存后的细胞很脆弱，溶解后的操作尽量要快，而且不要有过大幅度的震荡。我觉得你离心的时间和转速有点大，可以试试700rpm，离4min，之后缓慢加入培养液中。

清影

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6 k1 |1 \7 T0 w3 E0 [
8 L/ Q" H( T) b$ I6 e细胞融合应该达80%时冻存，90%已不是细胞的最佳状态；37度水浴速度要快，最好把冻存管口密封好，放入水中摇晃复融，时间要短，不要超过2min;之后无菌状态取出细胞放入到提前37度预热过的完全培养基中（我们一般1:9加）；离心转速太大了，我们是1200rpm，10min;收集细胞再次重悬后细胞计数，按一定比例接种即可。

askage

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! R& T4 B% [2 i% ]( e. t5 P9 V* [; D2 w& f; p9 V* k8 \
配方可以用文献的1:9（DMSO:血清）1 H# W8 I5 i) m. a
过程可以用简易或者程控降温. s$ \1 [$ C$ L7 B7 m, u! o
简易：4度30分钟，-20度2个小时，然后-80过夜，次日丢进液氮。这样活率也有60-80%

jhu132llh

xuehu20 发表于 2011-1-7 10:30 9 ^+ t8 ?& U! u% E& }
间充质干细胞150cm2的瓶中培养，融合度90%时冻存的，冻存液为DMSO:血清=1：9，复苏时在37度水浴锅中融化成半 ...

' s( u# @" p( b* j
1.融化的时候要尽快的并且可能的化成水，一般在37度2-3分钟都没问题的，不要半冰半水的，尽量在2分钟中化完冰；
  _$ o5 ~3 |/ E/ e/ C3 K2.化完后倒入的培养基是要预热而不是预冷，本来细胞还是半冰半水，你再给他冷却一下，肯定是要死很多的，因为复苏细胞时首先保证要在37度下迅速升温至37度的；, B( F+ H. }: a# ~* n0 b% T# d
3.冻存时加入了DMSO，复苏时要用5-10倍体积的培养液充分洗涤细胞，在离心沉淀细胞，以充分洗去DMSO，DMSO对细胞有毒害作用；2 d: Y: [8 n/ j1 \/ Z) h
4.台盼蓝染色只能简单说明情况，并不能真实反映细胞状态，只能作为参考而不是依据；* J  J4 A+ X# V  ~$ w) L

xuehu20

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. X: j  k6 r: u" Z8 @: q/ \5 X9 k7 J
你最终采取的方法是怎样的

xuehu20

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% D% i$ L- f: A! y6 o9 v% ~6 D; W1 \
能详细介绍下你的冻存复苏步骤及培养基、冻存液的配方吗