间充质干细胞复苏问题

一一

从楼主说的看，全死的定义让我有些疑惑，是什么样的？你知道污染也会导致的。如果排除污染，可能性只有两种：第一，冻存的时候，出现问题，关键是DMSO在常温时对细胞毒性很大，放置太长不好，但是有90%血清，按道理讲不至于全部死亡。第二，复苏的时候，即使没有离心再洗一次，但是你第二天换液也是可以的，血清可以保护细胞免受DMSO的损害，我曾经也复苏过一次，第二天换液全部死掉，呈团状，当时没有理会，以为是解冻太慢，又复苏一次，没有全部死，但也差不多了。最后我发现我犯了一个低级错误，培养基里竟让没有血清，以后就再也没出现这类问题。我认为，即使解冻慢，也不至于全部死，所以楼主的全部死具体是什么概念？

mbjane

我复苏过hUMSC,一般存活率比楼主的高，90%以上，复苏培养有时状态还行，有时状态较差，但是没出现过全漂起来的情况。% L3 K: T! O2 H0 w( E$ q' @& r
你的培养基没有问题吗？

askage

复苏过，冻了将近1个月后。文献的配方，自己摸索的配方都尝试过，复苏后活率都还有90%+。而且也成功继续传代扩大培养，从106长到108，没问题。没出现楼主说的那么严重的问题

xuehu20

回复 mbjane 的帖子. ]( Q5 o( i! v/ D, [1 Z& L  Y6 w
4 N$ F3 D7 @/ e% b% Y) R, z
能详细介绍下你的冻存复苏步骤及培养基、冻存液的配方吗

xuehu20

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5 M8 C: z2 @# m& U# m9 u
% s- T4 h/ K- ?+ j6 R% X( t你最终采取的方法是怎样的

jhu132llh

xuehu20 发表于 2011-1-7 10:30 6 E# v/ v+ p$ K6 u
间充质干细胞150cm2的瓶中培养，融合度90%时冻存的，冻存液为DMSO:血清=1：9，复苏时在37度水浴锅中融化成半 ...

$ r! y) U3 Y" B/ G, q8 I+ h$ n1.融化的时候要尽快的并且可能的化成水，一般在37度2-3分钟都没问题的，不要半冰半水的，尽量在2分钟中化完冰；
+ B6 J6 p) `, T, C- p$ n: l2.化完后倒入的培养基是要预热而不是预冷，本来细胞还是半冰半水，你再给他冷却一下，肯定是要死很多的，因为复苏细胞时首先保证要在37度下迅速升温至37度的；
; ~5 J7 X/ F, V0 r3.冻存时加入了DMSO，复苏时要用5-10倍体积的培养液充分洗涤细胞，在离心沉淀细胞，以充分洗去DMSO，DMSO对细胞有毒害作用；
$ g' z' g; ?( I' F4 q. e- L, i4.台盼蓝染色只能简单说明情况，并不能真实反映细胞状态，只能作为参考而不是依据；! C* ^3 l" `$ p

askage

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& l6 o; T1 l3 C
* b/ o2 @, H1 B4 ]- e配方可以用文献的1:9（DMSO:血清）
/ U; E$ L; C+ n+ Z1 o( w0 \  r过程可以用简易或者程控降温
& N$ H! ]! k- B简易：4度30分钟，-20度2个小时，然后-80过夜，次日丢进液氮。这样活率也有60-80%

清影

回复 xuehu20 的帖子3 g( y( E3 I5 l7 z1 Q

% U) b: V: s4 E& R% [; R细胞融合应该达80%时冻存，90%已不是细胞的最佳状态；37度水浴速度要快，最好把冻存管口密封好，放入水中摇晃复融，时间要短，不要超过2min;之后无菌状态取出细胞放入到提前37度预热过的完全培养基中（我们一般1:9加）；离心转速太大了，我们是1200rpm，10min;收集细胞再次重悬后细胞计数，按一定比例接种即可。

nydfy

冻存后的细胞很脆弱，溶解后的操作尽量要快，而且不要有过大幅度的震荡。我觉得你离心的时间和转速有点大，可以试试700rpm，离4min，之后缓慢加入培养液中。

83801754

40度水浴摇晃一分钟左右，最重要的是细胞的密度不能太低，否则就算是贴壁了，也很难长起来，而且确实会有不少细胞复苏后是不会贴壁的，下次换液的时候基本上就会换掉了，剩下的贴壁细胞密度太低的话，基本也就没指望了，个人经验，希望有帮助