双酶切连接的一些问题

sidalin301

最近在做双酶切连接，总是问题重重，请有经验的指导一二，多谢了！  s# t& W8 y% l# W1 n2 x- ~
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问题1：为什么转化、涂板、菌落PCR后除了目的条带（900多bp）外，还有很亮的300多bp的条带？
8 B+ i  b8 R9 P% X5 k8 E# z: ?" v问题2：转化菌涂板后放37度时间长了些，怎么每个较大的菌落周围都有很多微小的菌落？导致我后面挑克隆很难，也许挑的不纯，影响了菌落PCR的结果，怎么会有微小的菌落呢？这些菌落里面有没有目的片段？
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说明1：载体质粒（改造后的PNL）双酶切（Nhe1、BamH1）后进行胶回收，只有2条带，除了双酶切位点之间的300多bp的条带外就是一条10kb左右的质粒条带，
/ B% s! ~- |+ f/ [2 F2 a说明2：我用的是fermentas的连接酶5u/ul，说明书上说粘端连接时酶量为1u，就是只加0.2ul，我感觉不好取，所以就加了1ul进去，不知道这个会不会有影响？
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ghfvcat

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1：PCR有杂带不用管，你拿质粒去测序，对了就可以了
$ d8 e5 @0 I: _6 N; y1 {2：时间长了点是多长？24H？有几个可能的原因，一是抗生素有问题，或者是浓度或者是质量，所以导致没有抗性的克隆也可以慢慢长大，或者感受态有污染之类的，二是长的时间太长了，长出来的卫星菌落？
  {3 T, \7 G4 R* H连接酶加1UL肯定没有问题

siyue13

问题是你好浪费呀，本来可以多用几次的

张也行

PCR有阴性对照吗？是不是污染了之类的？
& A  U; f5 y$ _; ~" Z* _( X在细菌培养基上培养时间太长就容易在周围长卫星菌落，所以要及时挑菌，中间有抗性的菌把周围的抗性抵消了吧。6 z) O9 v; _+ J
酶的量用多了应该没有关系吧，我那次也是，好像没甚关系啊，哈哈 只要体系加对就行了，再说你的菌不是也长出来了吗？

chochochocho

总结你的情况：载体10kb，从双酶切（去除300bp）后胶回收；插入片段900bp
) ]. O# V- ?7 Q/ c( l问题1有关300bp杂带，1，引物是设计在载体上，插入片段两侧吗？做了blast么？2，胶回收时电泳是什么条件？怀疑你的双酶切有问题，10kb与10.3kb在胶上也区分不出来。3，所有的克隆都有300bp条带？2 t; U' ^9 o3 @8 e/ o1 K: r
问题2，赞同沙发。再有做好的抗性板儿1个月内用完最好，久了也不好解释问题。
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sidalin301

回复 ghfvcat 的帖子# N1 F  {  R9 x  R8 Y3 b" R. H5 I
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大概有18 个小时吧，时间久了为什么会长出卫星菌落？抗生素及其浓度没有问题，我做过对照，没有转化的细菌就没有长。

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子0 ^  {0 H3 E" f" }+ j
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引物两端带有酶切位点；没有做Blast，因为带酶切位点的引物无法做；几乎大部分克隆都有300bp的杂带；双酶切时就见到2条带，300bp和10kb。

sidalin301

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不像是污染，大部分克隆都有300bp的杂带；fermentas的连接酶的说明书上说粘端连接时酶量为1u，线性片段环化则加5u，我怀疑是不是加的酶量多了导致载体质粒自身环化？

张也行

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( e0 ~% X  A# H$ x$ B* ~回复 sidalin301 的帖子
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载体自身环化很正常的啊？ 你可以载体去磷酸化防止环化

ghfvcat

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大概原因就是菌落周围的抗生素被破坏了，18小时应该还可以，挑的时候挑大的克隆就行