双酶切连接的一些问题

sidalin301

最近在做双酶切连接，总是问题重重，请有经验的指导一二，多谢了！/ m* R( p9 |- K+ T% }
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问题1：为什么转化、涂板、菌落PCR后除了目的条带（900多bp）外，还有很亮的300多bp的条带？
6 @9 Z, W3 a* V4 G问题2：转化菌涂板后放37度时间长了些，怎么每个较大的菌落周围都有很多微小的菌落？导致我后面挑克隆很难，也许挑的不纯，影响了菌落PCR的结果，怎么会有微小的菌落呢？这些菌落里面有没有目的片段？
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# z7 I; D& z; j' l说明1：载体质粒（改造后的PNL）双酶切（Nhe1、BamH1）后进行胶回收，只有2条带，除了双酶切位点之间的300多bp的条带外就是一条10kb左右的质粒条带，
# ?# a: j9 i- Z( M, X8 P! Q, C说明2：我用的是fermentas的连接酶5u/ul，说明书上说粘端连接时酶量为1u，就是只加0.2ul，我感觉不好取，所以就加了1ul进去，不知道这个会不会有影响？- k7 S9 v" I0 x

sidalin301

回复 ghfvcat 的帖子
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1 `$ h/ i, `+ }0 a8 ?大概有18 个小时吧，时间久了为什么会长出卫星菌落？抗生素及其浓度没有问题，我做过对照，没有转化的细菌就没有长。

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子2 ?9 Q" _9 A7 Q. g8 k% n! ]3 g

5 L, K$ A* U0 `1 ?; ~引物两端带有酶切位点；没有做Blast，因为带酶切位点的引物无法做；几乎大部分克隆都有300bp的杂带；双酶切时就见到2条带，300bp和10kb。

sidalin301

回复 张也行 的帖子) s2 L5 n  K# s$ U

$ Q' F9 i+ N4 c3 \不像是污染，大部分克隆都有300bp的杂带；fermentas的连接酶的说明书上说粘端连接时酶量为1u，线性片段环化则加5u，我怀疑是不是加的酶量多了导致载体质粒自身环化？

sidalin301

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) T' L1 m' `( b* h; A) s; G, l' j% C$ C! ^9 {. A7 b9 }
这位大虾分析的很深刻，我也感觉是载体质粒双酶切不彻底造成的，那么怎么判断双酶切彻底不彻底？因为要做胶回收，双酶切体系里面质粒加的量少的话，条带很淡，回收难度大，如果加的量多的话又切不彻底，这该怎么处理呢？请指点一下，多谢了！

sidalin301

回复 mckf111 的帖子0 x+ [2 w* v. t

# N% y) `. Y5 J+ n; c5 u2 ^什么是STAR活性？

sidalin301

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3 d1 r  w; p8 g4 D0 v如果有300bp左右的缺口载体也可以环化吗?

sidalin301

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! m" d: s8 t/ W# k4 Z( m; r7 L, C( ~& |3 z$ _0 b2 c) ~
非常感谢这位大虾的帮助！
, E3 T3 }) z- s6 P/ lPCR产物没有单一的900bp的条带，有的是900bp和300都有的条带，由于有卫星菌落的存在，我挑克隆做PCR时可能不是太纯。
) J! d+ U1 x" M1 O4 `1 m/ T感觉双酶切的问题可能性最大，所以打算从头做，昨晚从新进行了双酶切，20ul体系质粒量只加了2ul(上次是加8ul)，限制酶各加1ul（10u/ul）。
2 @# E1 `) ]  `% v# n; c希望这次能成功，谢谢各位战友的帮忙！！！
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sidalin301

回复 chochochocho 的帖子8 C. F: O3 ^. N3 J
$ m: F8 N- X+ p
为什么10Kb里切300bp，20ul太小了？10u/20ul体系为什么不利于酶切彻底？
2 g6 F1 i5 ~* i6 Y/ S( A我看了fermentas的说明书，上面建议的单酶切体系就是20ul的，不过可以按比例扩大，由此可见双酶切20ul应该也可以。

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子# }8 f0 B: g2 P$ ~! D+ i
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不懂你的意思，你是说20u/20ul 限制酶的浓度太高了容易产生星活性是吧？我以前按这种体系切的时候没有看到杂带，就只有2条带！