双酶切连接的一些问题

sidalin301

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- k) L$ U3 C" e, O- |2 w5 E& y; m& {$ |# z* b7 [1 X$ {) P
郁闷啊，昨天下午连接、晚上转化和涂板，今天看来一下只长了几个很小的菌落，要不要再让它长几个小时？这样会不会长出卫星菌落？

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子0 p* H; Y8 v* G( L! S

8 G7 N; U+ H* W2 y6 M# [  H& B# N做了菌落PCR，怎么还是有2条带，图片如下，请帮忙分析一下，多谢了！

2011-1-17 17:25 上传

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2 Q7 D% r7 I1 V3 J4 D" a

sidalin301

D2000的Marker，由下到上依次为100、250、500、750、1000、2000，目的条带是上面那一条900bp左右，下面这一个条带是杂带，不知为何产生，请帮忙分析一下！

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子$ [- x( B) t/ j  G5 g
* `' }! z2 G6 L7 ^( \( _, p( l
酶切体系就是按照你说的设定的，50ul 体系，4ul 质粒，5ul buffer，限制酶各1ul，切过夜，不是有目的条带吗，你怎么说是negative的结果？

sidalin301

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) B3 M$ i6 @0 D8 R; q% g& Q. i# `; F, |) U5 k
你说的很对，我要做个blast才好。

sidalin301

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- ?3 s; E% h1 v# z0 s) q% f% x! b/ T7 s; {9 I% A; a
我设计的引物带有酶切位点，如果质粒自身环化了，那引物就有可能把质粒2个酶切位点之间的片段扩出来。
2 R- a, j$ H( _. s杂带要么来自于大肠杆菌，要么来自于质粒，我下面一个一个排除。谢谢帮忙！

sidalin301

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2 m7 P% u7 o9 i, u0 V; V
! ~: U- J/ G6 ?' f& B6 [& |5 `和大肠杆菌还是质粒blast？2个都能做吗？

sidalin301

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8 s# U. Y. m9 ?5 u0 L! C
$ W" }/ Y: ?/ `/ E: X6 B/ Z大肠杆菌和质粒的blast怎么做？弄了半天都显示操作失败！

sidalin301

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! z* h6 L0 k- Z7 [8 U
6 K* w- ]) H& M, @: G说的对，我也是这样想的，你的意思是说杂带是来自于大肠杆菌？那按道理说我就不用管它了，我的质粒已经连接成功了，是这样吧？

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子- x$ i1 ?7 _' X3 |  M4 J: K

: T6 K/ I% S" k6 I7 a. l7 s8 m" L9 g/ K难道不是这样吗？