双酶切连接的一些问题

chochochocho

8 v2 P# H, p, a
' W! e+ Z# n  o8 J" Z8 ]6 ?2 w回复 sidalin301 的帖子0 E( W6 h1 i5 I0 w

& c3 a! |" n9 z7 X' d9 K: J5 j1 N6 B, T谁说有酶切位点就不能做blast啊，只是匹配率的问题；也就是说NheI和BamHI序列是你引物的3'-端啦。那我认为就是双酶切不彻底，10Kb与10.3Kb你的肉眼确实看不出区别，当然只能看到两条带啊。就如你说‘大部分克隆都有300bp’，也就是只有900bp的就是酶切彻底的，你也可以先选择他们做测序，或选择其他酶切位点做验证。如果你想证明，你就选一个300bp，900bp都p出来的克隆，和一个只有900bp的克隆，做NheI/BamHI双酶切啊，看看是不是3条和2条带。
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为什么你认为是载体自连呢？载体NheI/BamHI之间有300bp么？

mckf111

有没有可能是STAR活性？

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子7 K7 @  U7 M/ l. U8 s
" _" u4 Y6 ]- N( @7 Z0 G- y
这位大虾分析的很深刻，我也感觉是载体质粒双酶切不彻底造成的，那么怎么判断双酶切彻底不彻底？因为要做胶回收，双酶切体系里面质粒加的量少的话，条带很淡，回收难度大，如果加的量多的话又切不彻底，这该怎么处理呢？请指点一下，多谢了！

sidalin301

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* Q7 [$ d0 R$ L) s# W+ `3 A+ S  y0 y- `4 o/ ?
什么是STAR活性？

sidalin301

回复 张也行 的帖子. p5 }) Z- b& W$ f

% L* V. a) r! L: N如果有300bp左右的缺口载体也可以环化吗?

chochochocho

回复 sidalin301 的帖子. c" ]6 s4 x' i( `8 z

# _- o7 J+ T) e& s1 P4 N9 ~. j/ @9 I想解决双酶切问题并不容易的，PCR只有一条900bp带的克隆你可以进入下一步啊。那可以详细说一下你的酶切过程么？再帮你想一想。

chochochocho

回复 mckf111 的帖子1 Y% Q6 U; f' J$ M+ K) _( _

. Z2 i4 }* j% S. T5 {& H  P; O虽然BamHI有star，可此酶活性很低，切过夜也没问题，我想如果他加的不过量很多，应该不是问题；而且pcr产物与原载体十分相近，没切开的可能性更大。

sidalin301

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$ d# k, W. a+ D# G* @5 h1 X! ~# _) n. k
非常感谢这位大虾的帮助！
4 R# i8 x6 n: s( M. zPCR产物没有单一的900bp的条带，有的是900bp和300都有的条带，由于有卫星菌落的存在，我挑克隆做PCR时可能不是太纯。
$ @5 B4 ~& L5 v+ \4 X感觉双酶切的问题可能性最大，所以打算从头做，昨晚从新进行了双酶切，20ul体系质粒量只加了2ul(上次是加8ul)，限制酶各加1ul（10u/ul）。  M) G5 }: ~6 j, W$ P: E
希望这次能成功，谢谢各位战友的帮忙！！！
# ]* G: l" y6 a. F$ o

chochochocho

! v8 ~. k# Q6 w: w4 L: s

6 e! L, G% \7 z2 A' F: h8 T回复 sidalin301 的帖子
9 J6 J. J. y9 E, b, o5 ?" o: r* t' q2 s+ c$ e- L' K6 o
10Kb里切300bp，20ul？太小了吧。10u/20ul体系不利于酶切彻底，也较容易出现star。（具有star活性的酶容易在长时间酶切或高浓度使用时，酶切产生非特异片段，产物呈现散状，EcoRI比较典型）0 ~% g6 ?3 c* b6 Y3 _* E
建议：
' g- T# g% O( o( h! A2 B/ B. L9 \9 E1，体系：50-100ul
5 d% B% P: G' m' r) U# |2，酶：以NEB为例， 处理1ug质粒（10Kb，1site）
: d3 Y$ \' o, L+ h) s     NheI 7u" d/ J+ j  j0 H0 C& `
     BamHI 5u 6 D) q) z+ i; k' f  M9 @
理论可得：30ng300bp产物，做胶回收的话至少切5ug。! ~- ~( r' I( K
不知道你最近一次的结果怎么样，祝你好运！

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子/ {5 w. i2 d" i/ F$ i, U
8 J# W3 f( t. O2 |
为什么10Kb里切300bp，20ul太小了？10u/20ul体系为什么不利于酶切彻底？  d$ d( [% V' Q2 B! _! v
我看了fermentas的说明书，上面建议的单酶切体系就是20ul的，不过可以按比例扩大，由此可见双酶切20ul应该也可以。