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楼主: sidalin301
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[请教] 双酶切连接的一些问题   [复制链接]

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发表于 2011-1-14 09:40 |只看该作者
本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-14 09:45 编辑
( p3 ]) r; K8 |7 k" ?% h
* z% {2 `6 A# Z. E5 ^4 C" P, p回复 sidalin301 的帖子
- p/ x# b4 d' A: O
9 y3 ?, A# q5 x+ [1 x& I, Z谁说有酶切位点就不能做blast啊,只是匹配率的问题;也就是说NheI和BamHI序列是你引物的3'-端啦。那我认为就是双酶切不彻底,10Kb与10.3Kb你的肉眼确实看不出区别,当然只能看到两条带啊。就如你说‘大部分克隆都有300bp’,也就是只有900bp的就是酶切彻底的,你也可以先选择他们做测序,或选择其他酶切位点做验证。如果你想证明,你就选一个300bp,900bp都p出来的克隆,和一个只有900bp的克隆,做NheI/BamHI双酶切啊,看看是不是3条和2条带。
* R& D5 \8 V7 u5 R* {2 U9 T3 ]4 W0 J4 m
为什么你认为是载体自连呢?载体NheI/BamHI之间有300bp么?
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发表于 2011-1-14 10:24 |只看该作者
有没有可能是STAR活性?
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发表于 2011-1-14 14:39 |只看该作者
回复 chochochocho 的帖子* v1 B/ m8 |/ W8 M6 t% S: ^* c$ X

, L& S5 v9 }% L& f: m3 B7 j这位大虾分析的很深刻,我也感觉是载体质粒双酶切不彻底造成的,那么怎么判断双酶切彻底不彻底?因为要做胶回收,双酶切体系里面质粒加的量少的话,条带很淡,回收难度大,如果加的量多的话又切不彻底,这该怎么处理呢?请指点一下,多谢了!
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发表于 2011-1-14 14:40 |只看该作者
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回复 mckf111 的帖子
9 C' _7 m4 J) J! Z
! W% H. Z7 t. s2 ^# {. q- S什么是STAR活性?

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发表于 2011-1-14 14:49 |只看该作者
回复 张也行 的帖子
8 {+ u7 ~& x0 I* f; G8 b7 R
2 e: A, T8 b2 E4 E3 o3 o如果有300bp左右的缺口载体也可以环化吗?
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发表于 2011-1-14 21:59 |只看该作者
回复 sidalin301 的帖子
& J7 V+ s% R( M8 r5 g$ |$ j) W7 ~
想解决双酶切问题并不容易的,PCR只有一条900bp带的克隆你可以进入下一步啊。那可以详细说一下你的酶切过程么?再帮你想一想。
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发表于 2011-1-14 22:21 |只看该作者
回复 mckf111 的帖子1 B4 x* X. y  r  m' a1 D

6 ]: n1 t" @5 D6 u: T3 u. p$ R虽然BamHI有star,可此酶活性很低,切过夜也没问题,我想如果他加的不过量很多,应该不是问题;而且pcr产物与原载体十分相近,没切开的可能性更大。
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发表于 2011-1-15 10:18 |只看该作者
回复 chochochocho 的帖子
% u& v! R6 K; E1 [& n: J: ]0 J5 L' g; o$ L' r/ C. ], u% ~& \8 G/ e
非常感谢这位大虾的帮助!
' i, D, h5 z+ P, `) U2 b1 ]PCR产物没有单一的900bp的条带,有的是900bp和300都有的条带,由于有卫星菌落的存在,我挑克隆做PCR时可能不是太纯。& b6 _+ K% U' S* F
感觉双酶切的问题可能性最大,所以打算从头做,昨晚从新进行了双酶切,20ul体系质粒量只加了2ul(上次是加8ul),限制酶各加1ul(10u/ul)。
$ _( v5 f& F# ^. L" b2 w$ u希望这次能成功,谢谢各位战友的帮忙!!!
) ^( o. c# m2 G4 ^4 D. f
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发表于 2011-1-15 13:02 |只看该作者
本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-15 13:03 编辑
) E% B1 }( N( m# \, h8 H! j; Z( J2 J- v# M5 {2 i
回复 sidalin301 的帖子
4 U1 C1 I4 \  {" D7 _; F; j
1 J6 D- c- U! b8 d8 e2 ~10Kb里切300bp,20ul?太小了吧。10u/20ul体系不利于酶切彻底,也较容易出现star。(具有star活性的酶容易在长时间酶切或高浓度使用时,酶切产生非特异片段,产物呈现散状,EcoRI比较典型)
: n" z/ i/ D: Z. [( B' P7 {1 x( ]# |建议:
* u& T7 W9 W3 K. ~( s! N/ f1,体系:50-100ul
# G% ]9 z3 n) G7 J8 G# S2,酶:以NEB为例, 处理1ug质粒(10Kb,1site)- e8 l; ?! Z: y5 T
     NheI 7u3 p  J8 o, S$ W
     BamHI 5u + m9 S$ F+ t# `7 j
理论可得:30ng300bp产物,做胶回收的话至少切5ug。7 v+ v: a/ d9 z/ O! N; R9 M) E
不知道你最近一次的结果怎么样,祝你好运!
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发表于 2011-1-15 16:35 |只看该作者
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. k: w) }# {. [" v; E0 {. m2 R: X; }* A+ e; t6 E2 B
为什么10Kb里切300bp,20ul太小了?10u/20ul体系为什么不利于酶切彻底?5 f. @6 [9 Q- S6 l8 b
我看了fermentas的说明书,上面建议的单酶切体系就是20ul的,不过可以按比例扩大,由此可见双酶切20ul应该也可以。
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