双酶切连接的一些问题

chochochocho

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* z% {2 `6 A# Z. E5 ^4 C" P, p回复 sidalin301 的帖子
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9 y3 ?, A# q5 x+ [1 x& I, Z谁说有酶切位点就不能做blast啊，只是匹配率的问题；也就是说NheI和BamHI序列是你引物的3'-端啦。那我认为就是双酶切不彻底，10Kb与10.3Kb你的肉眼确实看不出区别，当然只能看到两条带啊。就如你说‘大部分克隆都有300bp’，也就是只有900bp的就是酶切彻底的，你也可以先选择他们做测序，或选择其他酶切位点做验证。如果你想证明，你就选一个300bp，900bp都p出来的克隆，和一个只有900bp的克隆，做NheI/BamHI双酶切啊，看看是不是3条和2条带。
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为什么你认为是载体自连呢？载体NheI/BamHI之间有300bp么？

mckf111

有没有可能是STAR活性？

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子* v1 B/ m8 |/ W8 M6 t% S: ^* c$ X

, L& S5 v9 }% L& f: m3 B7 j这位大虾分析的很深刻，我也感觉是载体质粒双酶切不彻底造成的，那么怎么判断双酶切彻底不彻底？因为要做胶回收，双酶切体系里面质粒加的量少的话，条带很淡，回收难度大，如果加的量多的话又切不彻底，这该怎么处理呢？请指点一下，多谢了！

sidalin301

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9 C' _7 m4 J) J! Z
! W% H. Z7 t. s2 ^# {. q- S什么是STAR活性？

sidalin301

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2 e: A, T8 b2 E4 E3 o3 o如果有300bp左右的缺口载体也可以环化吗?

chochochocho

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& J7 V+ s% R( M8 r5 g$ |$ j) W7 ~
想解决双酶切问题并不容易的，PCR只有一条900bp带的克隆你可以进入下一步啊。那可以详细说一下你的酶切过程么？再帮你想一想。

chochochocho

回复 mckf111 的帖子1 B4 x* X. y  r  m' a1 D

6 ]: n1 t" @5 D6 u: T3 u. p$ R虽然BamHI有star，可此酶活性很低，切过夜也没问题，我想如果他加的不过量很多，应该不是问题；而且pcr产物与原载体十分相近，没切开的可能性更大。

sidalin301

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% u& v! R6 K; E1 [& n: J: ]0 J5 L' g; o$ L' r/ C. ], u% ~& \8 G/ e
非常感谢这位大虾的帮助！
' i, D, h5 z+ P, `) U2 b1 ]PCR产物没有单一的900bp的条带，有的是900bp和300都有的条带，由于有卫星菌落的存在，我挑克隆做PCR时可能不是太纯。& b6 _+ K% U' S* F
感觉双酶切的问题可能性最大，所以打算从头做，昨晚从新进行了双酶切，20ul体系质粒量只加了2ul(上次是加8ul)，限制酶各加1ul（10u/ul）。
$ _( v5 f& F# ^. L" b2 w$ u希望这次能成功，谢谢各位战友的帮忙！！！
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chochochocho

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4 U1 C1 I4 \  {" D7 _; F; j
1 J6 D- c- U! b8 d8 e2 ~10Kb里切300bp，20ul？太小了吧。10u/20ul体系不利于酶切彻底，也较容易出现star。（具有star活性的酶容易在长时间酶切或高浓度使用时，酶切产生非特异片段，产物呈现散状，EcoRI比较典型）
: n" z/ i/ D: Z. [( B' P7 {1 x( ]# |建议：
* u& T7 W9 W3 K. ~( s! N/ f1，体系：50-100ul
# G% ]9 z3 n) G7 J8 G# S2，酶：以NEB为例， 处理1ug质粒（10Kb，1site）- e8 l; ?! Z: y5 T
     NheI 7u3 p  J8 o, S$ W
     BamHI 5u + m9 S$ F+ t# `7 j
理论可得：30ng300bp产物，做胶回收的话至少切5ug。7 v+ v: a/ d9 z/ O! N; R9 M) E
不知道你最近一次的结果怎么样，祝你好运！

sidalin301

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. k: w) }# {. [" v; E0 {. m2 R: X; }* A+ e; t6 E2 B
为什么10Kb里切300bp，20ul太小了？10u/20ul体系为什么不利于酶切彻底？5 f. @6 [9 Q- S6 l8 b
我看了fermentas的说明书，上面建议的单酶切体系就是20ul的，不过可以按比例扩大，由此可见双酶切20ul应该也可以。