双酶切连接的一些问题

chochochocho

( I" r" u2 ?5 v6 I/ N

$ D) X5 n5 j6 d# J' v回复 sidalin301 的帖子' H; `, o6 k( q/ g) T+ J

8 r* S0 F$ ^) i6 j1 G: y: n说明书的20ul体系里用了多少u的RE，我想应该不是20u吧。你明明用了20u/20ul，我写10u/20ul你也写10u，汗。; y% E4 |& R; i$ B
建议你查查为什么按比例扩大，跟能不能同时双酶切没关系。

sidalin301

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3 j: I$ X& P0 I2 D; A4 Q$ q* Y# @* L( e/ B) x# P/ y0 q
不懂你的意思，你是说20u/20ul 限制酶的浓度太高了容易产生星活性是吧？我以前按这种体系切的时候没有看到杂带，就只有2条带！

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子% M1 _( q) s' C7 I' s9 u0 _

& a5 j2 T# l; Q  L郁闷啊，昨天下午连接、晚上转化和涂板，今天看来一下只长了几个很小的菌落，要不要再让它长几个小时？这样会不会长出卫星菌落？

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子0 H# c0 d- i( a1 E8 ^6 s
/ m' n1 s- ~2 |6 G1 z
做了菌落PCR，怎么还是有2条带，图片如下，请帮忙分析一下，多谢了！

2011-1-17 17:25 上传

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9 l8 Q3 @; |* m, ~; V2 T

sidalin301

D2000的Marker，由下到上依次为100、250、500、750、1000、2000，目的条带是上面那一条900bp左右，下面这一个条带是杂带，不知为何产生，请帮忙分析一下！

mckf111

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7 H3 |5 r' F  ]% e
0 w9 I9 C4 @% {0 b8 e你查一下你的目的片段（900bp）内部有没有两种内切酶的位点

mckf111

+ y: J  S* w8 S& N: |# u9 l8 q& C

8 v" z8 e  p. e% D4 W- r你是用菌液PCR的吧？ 那么 更有可能的原因应该是你的菌自身基因组中也有个300bp的片段能用你的上下游引物扩出来$ A* z( x6 I8 r7 r# ^6 p
这样 你把空菌也做个PCR对照 再看有没有 如果有 就说明你扩出了基因组的DNA片段 没有 那再接着排除。。。

mckf111

sidalin301 发表于 2011-1-13 15:15
6 a' ?+ A5 D! `1 G6 t" ?回复 张也行 的帖子
1 K8 F( t* H2 S: m
& x8 X; }7 P' ^1 s  L不像是污染，大部分克隆都有300bp的杂带；fermentas的连接酶的说明书上说粘端连接时酶 ...

0 f, u! q% e+ Z' y8 l" K+ ?  G; D: V
自身环化如何解释你的结果？？？

mckf111

chochochocho 发表于 2011-1-14 22:21 $ ~# u" {6 \7 q5 M+ ^) C# k& [
回复 mckf111 的帖子# i0 G  u9 A- P. T
' j) n7 x4 c. ~. T  U
虽然BamHI有star，可此酶活性很低，切过夜也没问题，我想如果他加的不过量很多，应该 ...

% ?3 k; q0 R9 Q* V# h7 V
没切开怎么就能PCR出来 引物还是不匹配的啊 怎么能扩得出来？？？

chochochocho

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& K5 G, U9 b- Q/ B( D/ l6 t
, }; s9 {. K5 V: \你不设定好你的酶切体系，总拿negative的结果来鉴定，谁也没办法的。蛮干是最没有效率的，先把你实验的每一步骤的原理弄清楚吧。