双酶切连接的一些问题

sidalin301

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0 }$ x6 |* O5 `+ P+ t3 f+ ?/ s# L
酶切体系就是按照你说的设定的，50ul 体系，4ul 质粒，5ul buffer，限制酶各1ul，切过夜，不是有目的条带吗，你怎么说是negative的结果？

sidalin301

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! ^( r! X/ ?. p& R- W+ o# Y; c. B$ B" N' \: g- d
你说的很对，我要做个blast才好。

chochochocho

9 ~& }, }% i" L& H/ F
! J, Q5 O5 i5 S# F9 X5 V
回复 mckf111 的帖子) n9 j  k# U$ W4 O0 u6 H; s( p; X
0 M- n' L* u6 P& L
1，好像他设计引物时，没有blast吧，不知道特异性好不好。第一次回复他帖子的时候就说过blast，不知道为什么设计引物之前不做。
) s! f* `  @5 u8 |6 m6 I4 `6 m2，BamHI/NheI酶切位点3’端与引物至少有4个bp是完全相同的，如果没有切开，能批出来也是可能的。
* v5 [) y' o; H7 n( _9 I* {' \9 d我是猜测，所有的都只是说：可能性% f+ G5 y. w) J$ ^
我想他的体系有问题，再有他有900和300，增加了‘p出来没有切开的载体片段’的这种可能性

sidalin301

回复 mckf111 的帖子% ^- Y. B, v5 Y. B. Y  V# L

, Z* c' Z- h0 k+ t8 K我设计的引物带有酶切位点，如果质粒自身环化了，那引物就有可能把质粒2个酶切位点之间的片段扩出来。/ W! ^8 O6 [7 ~+ I) i4 O
杂带要么来自于大肠杆菌，要么来自于质粒，我下面一个一个排除。谢谢帮忙！

chochochocho

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- \1 Z+ [. G( C7 U5 T$ _2 @+ q6 o
& X4 e  w  T& |: I' D9 M  g还有一个提示：6 u- k: J" B; @/ z$ t' d! b! g
不知道你有没有验证你载体的BamHI和NheI酶切位点，单独酶切检测，看看位点是不是有效。

chochochocho

回复 sidalin301 的帖子6 u/ ?* _7 U# k
) u$ v% r# a$ W# Q$ f) j
可是你还是拿到了900和300，可以进行下一步么？不是还是重复了之前的结果？那就是negative啊。嗯，Blast，这是对的，如果Blast没问题，就有可能降低300是“没切开的”可能性。

chochochocho

# r$ n8 c! U# _* _) D4 E

0 v5 P3 [/ z) S) G" t5 j" ?* c回复 sidalin301 的帖子
) H+ p* ?: d, X) S* _2 ]8 y+ s* a5 J) d: b
4ul是多少ng？如果4ul是>5ug那你至少要用200ul体系

sidalin301

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  P9 J; V7 N5 [" q9 F! N& Z2 D) ]. L& [5 [! H
和大肠杆菌还是质粒blast？2个都能做吗？

jhu132llh

1.酶量过多的时候是会影响反应的
, _/ S% V/ v) ^( j: o2.是卫星菌，注意时间长了后就会有卫星菌的，影响挑单菌落

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子" z- u6 y; ]: i( e2 P+ O7 L

* Y5 ~: S) `' ~大肠杆菌和质粒的blast怎么做？弄了半天都显示操作失败！