双酶切连接的一些问题

sidalin301

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0 {3 K$ x! H: D( K. l4 l' E' m0 y3 Z  j8 b/ E  E3 y8 e4 n
酶切体系就是按照你说的设定的，50ul 体系，4ul 质粒，5ul buffer，限制酶各1ul，切过夜，不是有目的条带吗，你怎么说是negative的结果？

sidalin301

回复 mckf111 的帖子8 `9 R* E# F) a. x; |! ]6 O
3 H# D/ t# g5 {; l% ?" g  g
你说的很对，我要做个blast才好。

chochochocho

- o3 n1 W% k* b. k! k* d

) a2 M0 A( G6 v7 _1 v2 M回复 mckf111 的帖子0 c6 o0 p0 L" p

) z0 L3 m2 T- N) F: q- K* R1，好像他设计引物时，没有blast吧，不知道特异性好不好。第一次回复他帖子的时候就说过blast，不知道为什么设计引物之前不做。0 z9 K# r+ M# P3 {- n# a3 d' l9 ^9 }
2，BamHI/NheI酶切位点3’端与引物至少有4个bp是完全相同的，如果没有切开，能批出来也是可能的。
+ X3 r2 {* p& q) d; \2 R我是猜测，所有的都只是说：可能性  \! |1 w! a1 s( R( B
我想他的体系有问题，再有他有900和300，增加了‘p出来没有切开的载体片段’的这种可能性

sidalin301

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" k  C$ g; r4 y5 L0 \3 E& P7 I/ p" N" \4 U( @6 z
我设计的引物带有酶切位点，如果质粒自身环化了，那引物就有可能把质粒2个酶切位点之间的片段扩出来。
" _2 [% ?# G. _, C3 ^  m杂带要么来自于大肠杆菌，要么来自于质粒，我下面一个一个排除。谢谢帮忙！

chochochocho

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5 u$ A& R2 N! B& S4 X9 Q- k6 d
! j, b  j# a& a- }- W还有一个提示：
' R0 V" i3 E- M3 F8 A2 I* Y不知道你有没有验证你载体的BamHI和NheI酶切位点，单独酶切检测，看看位点是不是有效。

chochochocho

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3 h  s% @  e, f  F2 c3 B; {7 E! u) k4 J
可是你还是拿到了900和300，可以进行下一步么？不是还是重复了之前的结果？那就是negative啊。嗯，Blast，这是对的，如果Blast没问题，就有可能降低300是“没切开的”可能性。

chochochocho

$ G- z* e. [$ q2 I5 z  U; ?; _

' O7 V3 I* Q5 x* h1 ^回复 sidalin301 的帖子
" D: D) a5 `, c7 Y' ^
  \1 W* i/ x  I: d# a2 S5 n3 }3 e4ul是多少ng？如果4ul是>5ug那你至少要用200ul体系

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子6 G* |% q. o6 v" i# {; \* l* ?

3 q. J( y. e2 H' z和大肠杆菌还是质粒blast？2个都能做吗？

jhu132llh

1.酶量过多的时候是会影响反应的
2 P/ b4 A  [# u& i4 k. ~! T2 C+ ]2 V# L7 E2.是卫星菌，注意时间长了后就会有卫星菌的，影响挑单菌落

sidalin301

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4 A2 {, S) z, |9 m  c, `  E5 c' ]9 r8 F5 I% a3 ]! h1 e4 W' D8 o& N/ N
大肠杆菌和质粒的blast怎么做？弄了半天都显示操作失败！