双酶切连接的一些问题

sidalin301

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$ j3 a9 ?% E. ]7 w( b; }% [6 W) H6 ^% x5 M) R" O- n# k
郁闷啊，昨天下午连接、晚上转化和涂板，今天看来一下只长了几个很小的菌落，要不要再让它长几个小时？这样会不会长出卫星菌落？

sidalin301

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9 y, w! A3 C. }; I( r, \, H( Z" B9 l2 Y- k
做了菌落PCR，怎么还是有2条带，图片如下，请帮忙分析一下，多谢了！

2011-1-17 17:25 上传

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& D" O8 ]9 z2 Z/ E# O% \

sidalin301

D2000的Marker，由下到上依次为100、250、500、750、1000、2000，目的条带是上面那一条900bp左右，下面这一个条带是杂带，不知为何产生，请帮忙分析一下！

sidalin301

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3 d, w, O* r* [% X6 Z; O- O
. k6 F/ H0 q6 `/ Q1 B! S3 p酶切体系就是按照你说的设定的，50ul 体系，4ul 质粒，5ul buffer，限制酶各1ul，切过夜，不是有目的条带吗，你怎么说是negative的结果？

sidalin301

回复 mckf111 的帖子2 x. y2 m% F" a1 y
5 |. j* H) m( L; P& c+ L6 J/ M, V
你说的很对，我要做个blast才好。

sidalin301

回复 mckf111 的帖子8 m2 }. P3 F6 D0 C
' Z# n2 h/ u. M% ~
我设计的引物带有酶切位点，如果质粒自身环化了，那引物就有可能把质粒2个酶切位点之间的片段扩出来。& H, m5 M2 \# {5 H4 M) Q
杂带要么来自于大肠杆菌，要么来自于质粒，我下面一个一个排除。谢谢帮忙！

sidalin301

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6 S* v3 D2 t0 ~: i4 F5 W
, f2 v6 x0 q; P8 I1 r. i和大肠杆菌还是质粒blast？2个都能做吗？

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子( y0 g: d7 Q# J6 F* x. M) x
; d* Q! O* J# P) [/ N. Y$ B
大肠杆菌和质粒的blast怎么做？弄了半天都显示操作失败！

sidalin301

回复 mckf111 的帖子- q3 T2 t7 l% c( g

% A+ W( z  [4 ]# I$ u说的对，我也是这样想的，你的意思是说杂带是来自于大肠杆菌？那按道理说我就不用管它了，我的质粒已经连接成功了，是这样吧？

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子6 R! Y2 W  Z& s% C2 l

! Y! T! T) b. ]+ p) T! R难道不是这样吗？