双酶切连接的一些问题

sidalin301

最近在做双酶切连接，总是问题重重，请有经验的指导一二，多谢了！& E  ?1 B6 @" g2 J1 N

$ e+ I/ }; q" ^/ r9 s8 g问题1：为什么转化、涂板、菌落PCR后除了目的条带（900多bp）外，还有很亮的300多bp的条带？
5 q( c" L( O9 b9 ~! k6 F. U问题2：转化菌涂板后放37度时间长了些，怎么每个较大的菌落周围都有很多微小的菌落？导致我后面挑克隆很难，也许挑的不纯，影响了菌落PCR的结果，怎么会有微小的菌落呢？这些菌落里面有没有目的片段？2 d0 S& U; [$ T# C# H7 h
3 f0 @. q/ y: T/ v- P* ?- L

2 M+ Q1 o8 `7 o1 Q# }* q# I说明1：载体质粒（改造后的PNL）双酶切（Nhe1、BamH1）后进行胶回收，只有2条带，除了双酶切位点之间的300多bp的条带外就是一条10kb左右的质粒条带，
9 k* K" V4 ?8 `- `6 ~说明2：我用的是fermentas的连接酶5u/ul，说明书上说粘端连接时酶量为1u，就是只加0.2ul，我感觉不好取，所以就加了1ul进去，不知道这个会不会有影响？
, g& j$ Y! g5 T- z' L0 P: M

ghfvcat

回复 sidalin301 的帖子2 m! o3 l  z/ e: `$ c* a5 \
# u! g. G% D0 M6 }
1：PCR有杂带不用管，你拿质粒去测序，对了就可以了
) l4 x8 S- B; m% K; k! l2：时间长了点是多长？24H？有几个可能的原因，一是抗生素有问题，或者是浓度或者是质量，所以导致没有抗性的克隆也可以慢慢长大，或者感受态有污染之类的，二是长的时间太长了，长出来的卫星菌落？% f# I; e9 ]) o4 O4 w' u* [
连接酶加1UL肯定没有问题

siyue13

问题是你好浪费呀，本来可以多用几次的

张也行

PCR有阴性对照吗？是不是污染了之类的？; Q! v" {7 i9 _
在细菌培养基上培养时间太长就容易在周围长卫星菌落，所以要及时挑菌，中间有抗性的菌把周围的抗性抵消了吧。
* u; a, X8 v1 m$ p* @$ u8 W( C  S酶的量用多了应该没有关系吧，我那次也是，好像没甚关系啊，哈哈 只要体系加对就行了，再说你的菌不是也长出来了吗？

chochochocho

总结你的情况：载体10kb，从双酶切（去除300bp）后胶回收；插入片段900bp
: L7 }( M; {5 g+ t  S) D, ]问题1有关300bp杂带，1，引物是设计在载体上，插入片段两侧吗？做了blast么？2，胶回收时电泳是什么条件？怀疑你的双酶切有问题，10kb与10.3kb在胶上也区分不出来。3，所有的克隆都有300bp条带？& U% r: Y8 c! z! j" K2 ]2 B9 d% D
问题2，赞同沙发。再有做好的抗性板儿1个月内用完最好，久了也不好解释问题。
' u+ r8 G* W! Y) A% I. C

sidalin301

回复 ghfvcat 的帖子) [  W; H3 S2 O9 q- H, |( g0 C; Y

- D4 j/ T- Y4 x$ A$ _; \3 S* P/ Y大概有18 个小时吧，时间久了为什么会长出卫星菌落？抗生素及其浓度没有问题，我做过对照，没有转化的细菌就没有长。

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子
' Y, f* ]; J0 l9 x( Z
4 s  c+ h. \; f3 J引物两端带有酶切位点；没有做Blast，因为带酶切位点的引物无法做；几乎大部分克隆都有300bp的杂带；双酶切时就见到2条带，300bp和10kb。

sidalin301

回复 张也行 的帖子
/ Z# ?5 o4 K0 V) j) A! Z  g/ D. ?( j; L9 _+ B3 J2 ~' w* C& s" p
不像是污染，大部分克隆都有300bp的杂带；fermentas的连接酶的说明书上说粘端连接时酶量为1u，线性片段环化则加5u，我怀疑是不是加的酶量多了导致载体质粒自身环化？

张也行

( |/ G9 s3 L0 L
* t9 f) K; U/ t& o回复 sidalin301 的帖子
) S2 {9 L7 ?- Q( P
# m) S% J0 D) d载体自身环化很正常的啊？ 你可以载体去磷酸化防止环化

ghfvcat

回复 sidalin301 的帖子
! T0 F' x2 x' M, p  B4 T2 a1 J2 c; O% }, ?; V3 ^4 u$ |( m
大概原因就是菌落周围的抗生素被破坏了，18小时应该还可以，挑的时候挑大的克隆就行