请教一个连接反应的问题

mckf111

最近在做双酶切 总是长不出克隆 设了各种对照 焦点最终落到连接和感受态两步上
; Q  X8 [2 {' v6 A$ s) P3 r; t感受态问题已解决+ u( @& d6 ~9 a7 F- W" I
关于连接 我突发奇想 在10ul的连接体系中取了5ul去跑胶 按照预期 连接成功应有1条 不成功则2条 我估计两样都有 那应该是3条5 i: C0 L0 ]0 R3 P+ v% Q7 O3 c
可最终结果是——0条* e0 {9 p  g/ ^6 O# g! c+ k0 K
哪位大牛能给我解释下& M4 `) k& o0 e
P.S.有师兄说 可能浓度太低 条带看不到 但我觉得不可能 因为我酶切-跑胶-回收之后 将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 按照前述经验 不可能浓度淡到看不出条带 大家赞同不？？？

mckf111

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- [# @1 N- E+ n* c8 k0 L) |; |! f; k7 v+ e; n$ f2 M# M4 O
我说了个大概 准确的是载体1ul；目的片段7.8ul；10×BUFFER 1ul；酶0.2ul，总共10ul。+ h+ ?- T' u% w( g, r
可能您会怀疑酶怎么这么少，因为我用的是fermentas的T4连接酶（和另一个帖子里仁兄说的一样），其为5u/ul，说明书上说20ul的体系只要用1个u，我的10ul体系加了0.2ul（相当于1u）应该还超量了。。。因为没有0.1ul的枪，没办法。。。

mckf111

0 w$ r: X' ^9 u) |' B7 u9 \$ }: m. B2 T& q" ?
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5 D* s+ R% I& O# |* _! \
% M9 Z( |, U2 @& ]7 x谢谢 目的片段用胶回收KIT 最后应该是Eluent溶解的 应该是Tris 那MQ是什么？0 c  M3 N+ v8 I" `4 O
但不管咋样 我加进去的DNA怎么都看不到呢 我很疑惑。。。

mckf111

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' @- I7 A  O! ~& n2 H; @) D! f! g9 O7 b  j
原来是超纯水啊～～( ~) i& K5 E( _  d# d7 @4 M
做了电泳啊 咱这分光计坏了 没具体去测 但用5ul跑出来 质粒和目的基因亮度相当 而且有一般内参那种亮度 我想浓度应该不会差的
) r+ x9 V1 P- L" W3 u. M“离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。”这句话我没太看明白 求详

mckf111

回复 chochochocho 的帖子5 @' T* i7 s! {
# ~: b* s) x, H. k
那会不会导致因目的片段太少 连接产物过少啊 不说一般都要是质粒的3-10倍么。。。- O$ N) ^/ `# z4 K: H
另外 剩下来的体积是用ddH2O补齐么？看师兄们做的时候 都不加水的 把目的片段代替水猛加。。。

mckf111

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" H0 r' m, p) l+ q5 B( c
# w5 d0 u! x2 `, ^0 P5 _结果是8个克隆5个阳性或者更高。。。
3 ~' Q/ z9 q! H7 K' A' K6 R那如何浓缩DNA呢 洗脱的时候说明书上就是要25-30ul的洗脱液洗脱 那如何对洗脱下来的DNA浓缩？
( R* N8 `6 s0 A4 S/ r$ t$ `MQ我们轻易不给用 穷。。。

mckf111

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$ D% q7 o$ r5 G( n9 S& A5 i3 k: l2 {3 t
不会太大跑不出来 我目的片段很小 就200多bp
! I2 z* w8 Y0 J& y1 `重复了三次 还是这样 我等下传张图上来

mckf111

2011-1-16 10:15 上传

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: u8 D9 Z/ J- ]5 V0 \+ y% |第二泳道为MARKER 最下面是100bp 最上面是1500bp 最亮的是500bp
& ]: e1 u1 g/ ^* U! N. c* G1 ?( Z第三泳道是质粒+288bp目的片段% {& @: [2 i3 e+ O; w9 E/ l
第四泳道是质粒+570bp目的片段
9 v: N- D5 B) M质粒为pIRES2-EGFP，大小为5.3kb，选择的双酶切位点分别是上游BglⅡ，下游EcoRⅠ。
0 n9 a+ H6 S2 \; j/ q& L8 Y这是我昨天晚上做的连接，体系是：1.5ul 质粒+11ul 目的片段+1ul T4 ligase+1.5ul 10×BUFFER=15ul 体系，16度过夜，早上起来取了4ul跑电泳，就出来上述图，杯具。。。. O- F: |  x# `  m3 @5 c! f0 V
P.S. 因为昨天担心是不是酶和BUFFER有问题，于是用了师兄的来做，TAKARA的ligase和10×BUFFER，可结果。。。